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【摘要】 目的 探讨性别决定区基因（SRY）在性分化和发育中的作用。 方法 细胞遗传学核型分析以及PCR技术检测外周血SRY基因。 结果 病例1的核型为46，XX，SRY（+）。诊断为46，XX男性性反转综合征。病例2的核型为46，XX/45，X，SRY（-）。诊断为Turner嵌合型。 结论 SRY基因检测比Y染色体更能预示睾丸组织的存在，是诊断性别发育异常患者的重要手段。性腺的病理取决于性腺组织的染色体核型和SRY基因。除SRY基因外，还存在多个参与性别决定和分化的基因，性分化异常表现高度遗传异常性。
关键词 性分化异常 核型分析 聚合酶链反应 性别决定区基因
Analysis of the cases of the46，XX male and46，XX/45，X
Li Min，Liu Hongxi
Shantou University Medical College，Shantou515031.
【Abstract】 Objective To study the role of SRY gene in abnormalities of sexual differentiation and develop-ment.Methods The karyotype analysis technique of the cytogenetics combined with polymerase chain reaction（PCR）were used to detect the SRY gene of peripheral blood.Results Karyotype of case1is46，XX，SRY（+），was diag-nosed46，XX male sex-reversal syndrome.Karyotype of case2is46，XX/45，0，SRY（-），was diagnosed Turner mo-saic syndrome.Conclusion SRY gene detection is more sensitive and specific than the Y—chromsome in the predic-tion of the presence of testicular tissue.It is the important tool diagnosing sex development abnormal.Besides SRY gene，there are more gene determining sex and differentiation.The sexual differential abnormalities express highly the genetic heterogeneity.
Key words abnormal sex differentiation karyotype analysis polymerase chain reaction SRY gene
性反转综合征和Turner嵌合型综合征均属性分化发育异常范畴。其中，性反转综合征群体发病率为1/20000，而Turner综合征发生率为1/2500，为女婴。这类疾病长期困扰着患者及其亲属。他（她）们无法真实识别自己的性别，严重地困扰着他们的身心健康。而对其诊断临床上一直沿用真假两性畸形的方法 ［1］ ，但不能确诊其真实性别。自Sinclair等 ［2］ 发现Y染色体上存在着性别最佳候选基因性别决定区基因（SRY）以来，性别分化异常的临床诊断便进入了分子遗传学诊断水平。我室在多年开展染色体病的细胞遗传学诊断的基础上，应用PCR扩增SRY基因保守系列，从分子水平提示上述病例性分化异常的原因，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 病例1，患者，8岁，社会性别男，因外阴发育不良先后2次来我室检查，发现患儿阴茎屈曲，短小，阴囊发育不良，触摸不到睾丸。蹲式小便，小便从阴囊上方小孔排出。二维彩色超声多普勒显示:在下腹有睾丸（下6cm×下6cm）声像图，右下腹未见睾丸回声。病例2，患者，女，26岁，因月经混乱、不孕来我室检查。患者诉说婚前曾来潮，婚后无月经。随后因不孕导致婚姻破裂。医院发现其子宫后位、较小，性腺发育不全，外阴模糊，阴道短浅、体多毛、睾酮升高（12.7nmol/L）。
1.2 方法
1.2.1 细胞遗传学 采用外周血淋巴细胞培养法常规制片，胰酶消化法G显带，按照国际细胞遗传学命名体制（IS-CN）进行核型分析。必要时做C显带检测。
1.2.2 PCR法检测SRY基因 （1）提取基因组DNA:按哺乳类血DNA分离试剂盒（Beohringer Mannhein）说明书提取基因组DNA，并用TE（pH8.0）溶解后贮于-20℃冰箱备用，正常男性和女性DNA标本分别取自性分化正常的成年男、女外周血，并用惠普8452A紫外光度计测定其CD值。（2）PCR扩增:SRY基因引物（W13420、W13421）序列和作为对照的α-类重复序列（W13422、W13423）见表1。
表1 引物碱基序列及扩增长度（略） 两对寡核苷酸引物由上海Sangon公司提供。在25μl PCR反应系中，加入10×buffer2.5μl，MgCl 2 （25mmol/L）2.0μl，dNTP（10mmol/L）0.5μl，引物各2.0μl，模板DNA2.0μl，加纯净水蒸25.0μl后盖以30μl液体石腊油94℃40s、55℃30s、72℃40s，35个循环。于72℃延伸5min。在PTC-100DNA扩增仪（美国MJ Research）上进行扩增，琼脂糖凝胶电泳，取PCR扩增产物10μl，加2.0μl溴酚蓝-二甲苯青混匀后上样，于20%琼脂糖凝胶中电泳，电压5V/cm，电泳后于紫外线灯观察结果并照相记录。
2 结果
病例1:染色体G显带结果表明，核型为46，XX，SRY（+），诊断为46，XX性反转综合征。病例2:染色体G显带结果表明，核型为46，XX/45，X，SRY（-），诊断为Turner嵌合体综合征。SRY检测结果如图1所示。1.正常男性 2.空白对照3.性反转综合征患者4.Turner嵌合型综合征患者5.正常女性
图1 SRY基因扩增产物电泳图（略）
3 讨论
人类正常性发育包括性别决定和性别分化两个阶段，前者可能是SRY基因为主导，一系列基因参与协调表达的调控串模式。后者则可能是由SRY决定性别后，在其他因素参与下共同完成的。SRY基因定位于YP11.32，编码一种含204个氨基酸的核蛋白（SRY蛋白），在胚胎发育早期的性腺组织中有短暂表达，导致原始性腺组织向睾丸组织分化。在其核心区，含约80个氨基酸保守区段，称SRY基因HMG盒，能特异性地识别和结合核心序列为5'-CCTTTGA-3'的DNA片段，从而对其受控基因的编码进行调控。很明显，其间若发生基因突变（碱基置换、缺失或易位）均可导致SRY蛋白失活，使46，XY者成为女性表型。SRY基因已成为目前研究TDF的最佳候选基因，为早期诊断性分化异常奠定坚实的分子遗传学基础。大量临床实践表明，一般情况下，性分化异常不论其核型如何，只要SRY阳性，就会有睾丸组织存在，且不论其在什么部位（盆腔、腹股沟、阴阜等），或以什么形式（卵睾、发育不良的睾丸、条索状性腺等）存在，而有无发育不良的睾丸组织则是临床决定手术的指征 ［3］ 。
病例1，血核型为46，XX，但SRY阳性。证实了临床检查的结果。病因可能是其父在形成生殖细胞时，XP/YP进行了同源交换或Y-DNA易位到常染色体上。此种异常精子与卵子受精形成核型为46，XX并有睾丸组织的个体。染色体原位杂交（FISH）可以证实是否有易位的Y染色体DNA片段的存在。但也有学者认为可能由于基因突变，即受控于TDF的常染色体上的应答基因发生突变，进行自行表达，产生46，XX男性个体或存在嵌合体核型等。目前发现，除SRY基因外，还有其他一些与睾丸决定性别分化有关的基因 ［4］ ，如WT1、SOX9、SF1、MIS、SIPs、XH2、DAX-1、Wat家族等或由于受检组织的细胞核型不同于性腺组织或由于易位到X短臂上的Y-DNA序列很短，以致一般分子杂交手法无法检出等。化爱珍 ［5］ 曾报道1例46，XX，SRY（+）患者，发现SRY基因序列在HMGbox内存在着 Codon112GAG→GAC。本例是否也存在着基因突变，有待 测序加以证实。在此类性反转综合征中，发现尚有1/3的46，XX男性患者，却未能检出SRY基因，而且无Y-DNA片段的患者，其男性化程度比有Y-DNA者个体小 ［6］ ，说明导致性反转和性分化异常必定还有别的机制。
病例2，血核型为46，XX/45，X嵌合体，SRY（-），但睾酮升高。其原因可能有SRY以外的其他因子与睾丸生成有关。自Capella ［7］ 提出常染色体显性的性别决定基因（TD-FA）以来，先后报道了9q24存在一个隐性的睾丸形成基因，10q26.1-qter存在一个或多个性别决定及分化相关基因。在性反转男性中，也有45，X和47，XXX男性的报道，如郁琦等 ［8］ 1995年报道1例无Y染色体，SRY阴性但有睾丸的真两性畸形。这些材料进一步证实了性别决定是以SRY基因为主导，一系列多个基因参与协调的结果。其次，血核型在一般情况下是与性腺性别相一致的。但有时并不能完全反映性腺病理状况，原因在于皮肤和性腺组织均来自外胚层，而外周血组织则来自中胚层。在胚胎发育早期若发生基因突变，则有可能导致不同胚层的不同核型。因此，了解皮肤细胞的核型更能了解性腺的真实情况。至于本例嵌合体核型形成机制很可能是受精卵在早期卵裂发生X染色体遗传所致。
细胞遗传学核型分析结合PCR法检测SRY基因，能特异而快速确认基因组是否存在SRY基因，从基因水平揭示性发育异常的原因，为临床治疗提供新的依据。如病例1后来在本院附属二医院实施手术，还她一个女儿身，就是一个例证。外生殖器异常不仅涉及患者体内代谢紊乱问题，更存在着性别抉择问题，应尽快明确诊治，以免造成性征混乱及性心理创伤，甚至可预防癌变。研究表明，青春期后80%患者发育不良的睾丸可发生恶变，其恶变率随年龄的增大而增加，故早期手术切除发育不良的睾丸组织很有必要。性反转和性分化异常既是生殖医学研究的重大课题之一，又是涉及患者终生幸福的极其复杂的问题。根据对SRY基因产物及其功能的分析，应有其调控的下游基因又不排除调节其表达的上游基因。因此，寻找SRY基因的突变、易位的Y-DNA片段、嵌合体以及参与性腺发育的其他基因，有待进一步研究。
参考文献
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2 Sinclair AH，Palmar MS.A gene from the human sex-determining re-gion encodes a proteinwith homology to a conserved DNA binding molif.Nature，1990，346:240.
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8 郁琦，黄尚志，叶丽珍，等.SRY基因检测对性分化异常诊断及分类的意义.生殖医学杂志，1995，4（1）:6.
（编辑新 竹）
作者单位:515031广东汕头大学医学院