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人类基因组研究标志着生命科学进入一个从总体、综合角度理解生命活动的分子基础新阶段。基因的功能主要通过其编码的蛋白质来实现，但一个基因碱基序列并不代表可以识别这个基因所编码的蛋白质，因为一个基因可以产生出多个蛋白质，如人的一个基因大约可编码10个蛋白质 ［1］ ;而且DNA序列信息不能说明蛋白质的翻译后修饰，一个蛋白质可能有400多个化学修饰来完成其功能、定位和活性 ［2］ ，如人心脏的HSP27蛋白，一个蛋白可修饰成59种蛋白 ［3］ 。在生命活动的过程中，基因是控制者，蛋白质才是真正执行者。在基因组计划完成后，蛋白质组学成为主要生命科学研究领域。蛋白质组学（proteomics）是对基因组编码的所有蛋白质进行大规模研究的一门科学。其研究目的是在蛋白质水平上阐明生理、病理过程的发生机制，为疾病诊断、治疗提供依据。在对疾病的研究中，以前主要是基于对病因确定的疾病研究。而疾病的发生往往涉及诸多因素，基因组学和蛋白质组学开阔了对于疾病研究的方法，为在生物学和医学方面研究疾病产生的分子和生理学机制提供了可能。
1 蛋白质组学的研究策略
蛋白质组学不仅需要研究生物效应与蛋白质群体在表达数量和性质上的关系，还需要进一步分析群体中各成分之间的相互作用。当前，蛋白质组学分为表达蛋白质组学和功能蛋白质组学 ［4］ 。表达蛋白质组学是对整个基因组或细胞、组织、器官中的蛋白质组进行大规模研究的方法。其研究方法是像基因组学研究，通过研究，获取人类3～4万基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组学数据库，而蛋白质比DNA的化学组成和分子结构更复杂，高通量地识别和鉴定蛋白质比较困难，在短时间内建立人类蛋白质组学数据库条件还未成熟;功能蛋白质组学是对在特定时间、特定环境和实验条件下，对特定蛋白质复合体的结构组成、功能及作用网络研究的一门科学。
2 蛋白质组学的方法
2.1 样品的准备 一个有效的样品准备是蛋白质组学研究成功的基础。在分析中所加入的试剂往往能扩大和潜在地破坏结果的正确性 ［4］ ，因此在样品制备中减少蛋白被破坏对于实验成功尤为重要。
2.2 蛋白质的分离技术 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE）技术现在依然是蛋白质分离的主要技术。它的第一相是根据多肽电荷大小不同进行分离的等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）;第二相则是基于多肽的分子量不同进行分离的十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术。但2-DE是不能解决分离蛋白的定量和收获量问题。对于这些问题，却有可能被其他的分离方法所解决。这包括毛细管电泳、高效液相色谱、高效液相色谱和质谱串联技术、蛋白质芯片、微序列分析，以及与2-DE相关的飞行质谱技术等。
2.3 蛋白质的检测 在常规的2-DE完成后，必须要检测蛋白质点的存在。需要包括考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色、放射性标记和免疫检测方法等的应用。虽然考马斯亮蓝染色的灵敏度比银染或荧光染色低10～100倍，但因为它的价格低廉、易处理和可用于蛋白质鉴定的质谱分析而被广泛使用 ［4］ ，其缺点是灵敏度较低和不能用于定量分析。选用灵敏度高而染色可靠的方法就非常重要。银染和荧光染色就被使用，虽然银染色灵敏度可达到1ng，但其缺点是重复性不好 ［4］ ，而且许多银染方法对某些种类的蛋白质染色差，如钙结合蛋白质和糖蛋白。荧光染色却不同，它与蛋白质浓度有较好的线性范围，有比银染较高的动态范围，以及与银染一致或更好的灵敏度 ［5］ ，并也能用于质谱分析。对于某些低丰度的蛋白质，由于放射标记的灵敏度比银染更高，可用它对低丰度蛋白进行鉴定。
2.4 蛋白质组的图像分析 图像分析需要在不同凝胶上进行蛋白质点的测定、定量和点的比较。由于在2-DE中内在的变化，除了自动图像处理程序外，一定程度的手动编辑也是需要的。在定量分析中，可信度很大程度依赖于图像软件的功能，这些软件一定能补偿标本装载、染色亮度和在电泳中的失真的变化 ［4］ 。常用的图像分析软件包有:Phoretix2D、AIDA、Image Master2D Elite、PDQUEST、MelanieⅢ和TOPSPOT。
2.5 蛋白质的鉴定 免疫印迹、协同泳动分析、依赖于自动Edman降解和氨基酸成分分析的微序列分析技术已广泛地被用于从2-DE来的蛋白质鉴定。用免疫印迹进行蛋白鉴定只能用高度特异性抗体测定已知蛋白。虽然这些技术已被广泛使用，但是它们都是既耗人力又耗时间的方法。高分辨率的2-DE和高灵敏度的质谱串联分析技术，以及快速增长的蛋白质和DNA数据库为蛋白质组学研究提供了更高效的方法。对于心脏蛋白组研究，主要数据库有HSC-2DPAGE和HEART-2DPAGE、HP-2DPAGE。
3 心脏疾病的蛋白质组学
心脏疾病是人类疾病中的常见病和多发病，如先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）发病率的波动范围为婴儿的4‰～50‰ ［6］ 。它不是一个统一的疾病实体，而是一个由多因素引起的综合征，包括高血压、慢性心脏病和心肌炎等。由于各种类型的心脏病发病原因至今不明，既有遗传因素，也有环境因素。这给心脏疾病的诊断、治疗造成了很多困难。蛋白质组技术用于心脏疾病研究，可弄清动态的蛋白质组和心脏疾病之间的关系，最终揭示心血管疾病的分子机制，为心脏疾病的诊断、发病风险估计、治疗和预后提供依据。蛋白质在心脏中发挥重要作用，从20世纪90年代开始，为了研究心脏疾病的发病机制，开始建立人和其他动物的心脏蛋白组数据库，以利于世界范围内不同实验室蛋白质数据的收集和蛋白质的对比 ［7］ 。在心脏疾病的蛋白质组学研究中，尤以扩心病（dilated cardiomyopathy，DCM）研究较多。DCM是一个收缩功能降低和心室扩大所引起的异质心脏疾病。与萎缩性心脏病相比，其发病机制还不是很清楚。遗传因素、感染性心肌炎、细胞因子活性、酒精滥用等致畸损伤和激素或生理影响都可导致发病。其每年的病死率占心脏疾病患者中的5%～15% ［8］ 。对于这种疾病目前只有进行心脏移植。至今已用蛋白质组研究方法进行了大量研究。在DCM中引发心肌收缩功能障碍的机制尚未清楚。通过生物化学方法，发现它的病理性改变为G蛋白介导的信号传递通道改变。这是β 1 肾上腺受体选择性的数量减少，增加了抑制性的G蛋白，削弱了钙离子动态平衡，或者是与较低的钙离子依赖Mg 2+ -ATP酶活性有关的收缩蛋白异常 ［9］ 。这些发现有可能只是由于血液动力学的过载所引起。因此，对DCM中特异性改变的候选蛋白的筛选越来越受到重视。
Jungblut等人运用2-DE分离蛋白，对一些特异蛋白进行了氨基酸分析和飞行质谱分析。通过比较DCM病人和对照组的右心室蛋白质组，发现25个有统计学意义的蛋白点，其中12个被鉴定 ［9］ 。在另一组实验中，对DCM晚期患者和正常对照的心脏进行蛋白质组分析，有52点有明显的平均强度区别。并对肌浆球蛋白轻链2（myosin light chain2，MLC2）和热休克蛋白27（heat shock protein27，HSP27）进行了蛋白质微序列和凝胶图谱分析。在DCM病人右心房中，其MLC2点强度比对照组增加了336%，HSP27比对照组降低了59%。因而这些蛋白被认为是DCM右心房的标志性蛋白。Pleissner等人在研究人类心肌蛋白时，发现在DCM心脏的右心室和左心房之间有40个点有量的差异，5个点有性质的差异。这5个有定性差异的不同点被确定为MLC蛋白簇、ATP合成酶α链等 ［10］ 。除DCM外，蛋白质组学研究也被用于其他心脏疾病发病机制的研究。Sun-Ah You等人运用此方法对冠心病的发病机制进行研究，研究表明在冠心病病人的冠状动脉中铁蛋白轻链的表达比正常人高，预示铁水平与冠心病的发病有关 ［11］ 。Arnott D等人运用2-DE技术，对心脏肥大性细胞的蛋白组进行了研究，发现11个有意义的蛋白质点 ［12］ 。
4 动物模型的运用
由于人类心脏疾病是由疾病状态、组织的情况、遗传改变等因素所决定，而且材料的获得也比较困难，因此人类心脏组织蛋白质组学研究是非常困难的。而其他的一些哺乳类动物具有与人相似的心脏结构和生理过程，并且可通过构建动物心脏疾病模型对相关蛋白进行研究。因此为了克服人的这些不利因素，利用动物模型进行研究就不失为一种好的方法。在DCM研究中，Buscemi等人对Rac1转基因小鼠进行蛋白组的研究，发现DCM的肌酸激酶M链蛋白点强度比对照组高1.6倍 ［13］ 。而肌酸激酶M链蛋白的改变在人类DCM病人中也被发现 ［14］ 。在这之前，运用2-DE技术对心动过速狗的心脏进行研究，发现了心肌蛋白改变。这些蛋 白质中的许多都与线粒体有关。Weekes J等对牛的遗传性DCM进行了研究，共有35种与疾病有关的心肌蛋白被发现有差异表达（其中有24种蛋白下调，11种上调），并且这些蛋白被鉴定。其中最有意义的泛素脱羧水解酶（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase，UCH）增加7成。这种去泛素化的酶是与支持细胞质中自由遍在蛋白池有关。鉴于此，他们提出了UCH的增加能提高遍在蛋白的聚集，并提高疾病状态下蛋白质遍在化，导致经过26S蛋白酶通道目标蛋白的质子作用。令人感兴趣的是，不适当的泛素连接与心脏疾病有关 ［15］ 。
Schwertz H等用人工合成丝氨酸抑制物FUT-175处理心肌局部缺血兔子模型，处理后心肌局部缺血得到缓解。对处理前后心脏蛋白质组进行研究，有10个蛋白点发生改变，其中超氧化物歧化酶前体和αB-晶状体蛋白下调一半 ［16］ 。Huang ZY等研究冠状动脉粥样硬化心脏病小鼠，用2-DE分离出2500个点，液相色谱/质谱联机分析出26个大量蛋白点;用PDQUEST软件分析获得38个意义点，其中MALDI-TOF-MS分析出12个高可信度点 ［17］ 。由此推测这些物质有可能成为诊治心脏疾病的靶标。蛋白质组学的发展和应用，使研究与人类疾病有关蛋白质表达的全面变化成为可能。虽然由于人类心脏疾病的复杂性和组织取材比较困难，人类心脏疾病的蛋白质组学研究还在初级阶段，但它作为基因组学的补充，在探索心脏疾病的发生机制，特别是运用功能蛋白质组学，在新的心脏疾病的诊断标志物、治疗目标物、潜在的药物靶蛋白、发病风险估计、预后等方面的研究，将在人类临床诊断和治疗心脏疾病中发挥极其重要的作用。
参考文献
1 Richard J S，Donna S D.Cancer proteomics:from signaling networks to tumor markers.Trends in Biotechnology，2001，19（10）:40.
2 钱小红，贺福初.蛋白质组学:从序列到功能.北京:科学出版社，2002，9.
3 陈晓岚，池志强.蛋白质组学在神经科学中的应用.生命科学，2003，15（1）:50.
4 Macri J，Rapundalo ST.Application of proteomics to the study of cardio-vascular biology.Trends Cardiovasc Med，2001，11:66-75.
5 Thierry Rabilloud，Thierry Blisnick，Manfred Heller.Analysis of mem-brane proteins by two-dimensional ectrophoresis:comparison of the proteins extracted from normal or Plasmodium falciparum-infected erythrocyte sts.Electrophoresis，1999，20（18）:3603.
6 Hoffman J，Kaplan S.The incidence of congenital heart disease.J Am Cell Cardiol，2002，9（10）:1890.
7 Jungblut P，Otto A，Zeindl-Eberhart E，et al.Protein composition of the human heart:the construction of a myocardial two-dimensional
electrophoresis database.Electrophoresis，1994，15（5）:685-707.
8 Schannwell C M，Schoebel F C.Left ventricular diastolic function pa-rameters after PTCA and stent implantation.Z Kardiol，2001，90（9）:621 -629.
9 Jungblut P，Zimny-Arndt U，Zeindl-Eberhart，et al.Proteomics in human disease:cancer，heart and infectious diseases.Electrophoresis，1999，20（10）:2100-2110.
10 Pleissner KP，Regitz-Zagrosek V，Weise C，et al.Chamber-specif-ic expression of human myocardial proteins detected by two-dimen-sional gel electrophoresis.Electrophoresis，1995，16（5）:841-850.
11 Sun-Ah You，Stephen R，Archacki，et al.Proteomic approach to coronary atherosclerosis shows ferritin light chain as a significant mark-er:evidence consistent with iron hypothesis in atherosclerosis.Physiol Genomics，2003，13:25-30.
12 Arnott D，O'Connell KL，King KL，et al.An integrated approach to proteome analysis:identification of proteins associated with cardiac hy-pertrophy.Anal Biochem，1998，258（1）:1-18.
13 Buscemi N，Doherty-Kirby A，Sussman M，et al.Proteomic analysis of Rac1transgenic mice displaying dilated cardiomyopathy reveals an increase in creatine kinase M-chain protein abundance.Molecular and Cellular Biochemistry，2003，251:145.
14 Aspenstrom P.Effects for the Pho GTPases.Curr Opin Cell Biology，1999，11:95.
15 Weekes J，Wheeler CH，Yan JX，et al.Bovine dilated cardiomyopa-thy:proteomic analysis of an animal model of human dilated cardiomy-opathy.Electrophoresis，1999，20:898.
16 Schwertz H.Two-dimensional analysis of myocardial protein expres-sion following myocardial ischemia and reperfusion in rabbits.Pro-teomics，2002，2（8）:988-995.
17 Huang ZY，Yang PY，Almofti MR，et al.Comparative analysis of the proteome of left ventricular heart of rteriosclerosis in rat.Life Sci，2004，75（26）:3103-3115.
（编辑商志伟）
作者单位:400016重庆医科大学生殖医学系