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【摘要】 目的 探讨不同死亡形式的卵巢癌细胞对巨噬细胞协同刺激分子CD80和CD86表达的影响及其可能机制。方法 以紫外线诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡，反复冻融诱导SKOV3细胞坏死。以薄膜-超声法制备含磷脂酰丝氨酸（PS）脂质体及磷脂酰胆碱（PC）脂质体。分别与脂多糖（LPS）作用下的人外周血单核细胞来源的巨噬细胞共同培养后，荧光显微镜下检测巨噬细胞对死亡细胞的吞噬及细胞免疫化学方法检测巨噬细胞CD80和CD86的表达。结果 巨噬细胞对凋亡与坏死的卵巢癌细胞SKOV3都能积极的吞噬，吞噬的比率分别为（35.3±6.9)%和 (31.2±4.1)%。但坏死卵巢癌细胞能显著增强巨噬细胞CD86的表达（P=0.013)，而凋亡卵巢癌细胞却不能增强巨噬细胞CD86表达（P=0.141)。坏死和凋亡卵巢癌细胞对CD80的表达均无显著影响（P=0.377,P=0.914)。PS及PC脂质体对巨噬细胞CD80（P=0.619;P=0.923)和CD86（P=0.414;P=0.816)的表达均无明显影响。结论 不同死亡形式的卵巢癌细胞对巨噬细胞协同刺激分子表达的影响不同，坏死的卵巢癌细胞上调巨噬细胞CD86表达，而凋亡的卵巢癌细胞无此作用。死亡细胞对巨噬细胞CD86表达的影响可能通过非PS途径起作用。
【关键词】 卵巢癌；细胞死亡；巨噬细胞；协同刺激分子；磷脂酰丝氨酸
Apoptotic or necrotic of ovarian cancer cell on macrophages CD80 and CD86 expression
CHEN Xiao-jun,LOU Hai-ya,ZHOU Cai-yun.
Department of Oncology,Gynaecology and Obstetrics Hospital Affiliated to Zhejiang University Medical College,Hangzhou 10006,China
【Abstract】 Objective To investigate the differential effect of apoptotic versus necrotic ovarian cancer cells on macrophages CD80 and CD86 expression and its possible mechanisms.Methods The ovarian cancer cell line SKOV3 was induced to apoptosis by ultraviolet rays and necrosis by rapidly freezing-thawing twice.Phosphatidylserine(PS)-liposomes and hosphatidylcholine(PC)-liposomes were prepared by vortexing and sonication.The two types of dead cells were respectively cultured with human monocyte-derived macrophages(HMDM)and LPS.After 24 hours,the phagocytosis assay was performed under fluorescence microscope.The two types of dead cells and two types of liposomes were respectively cultured with HMDM and LPS.After 18～20 hours,the expression of CD80 and CD86 were detected by immunocytochemistry.Results Both apoptotic and necrotic SKOV3 cells could be abundantly phagocyted by macrophages activated by LPS.The percent macrophages positive for uptake of apoptotic or necrotic SKOV3 cells was(35.3±6.9)%,(31.2±4.1)% respectively.However,the necrotic SKOV3 cells,but not apoptotic SKOV3 cells,upregulated the expression of CD86 molecule on the macrophages significantly.Both dead cells did not change CD80 expression on macrophages.The PS-liposome and PC-liposome had no significant effect CD80 and CD86 expression on macrophages elicited by LPS.Conclusion Macrophages activated by LPS can phagocyte apoptotic or necrotic SKOV3 cells,but the two types of dead SKOV3 cells have different effects on macrophages co-stimulating molecules xpression.Phosphatidylserine may not participate in regulation of CD80 and CD86 expression on macrophages by dead tumor cells.
【Key words】 ovarian cancer;cell death;macrophages;co-stimulating molecules;phosphatidylserine
初次手术后辅以铂类为主的联合化疗是进展期卵巢癌的标准治疗，铂类等细胞毒药物的作用以诱导肿瘤细胞凋亡为疗效终点。然而在一些炎症性疾病及自身免疫性疾病的研究中发现，凋亡与坏死作为不同的细胞死亡形式，对局部的免疫功能有着完全不同的影响［1］。巨噬细胞是死亡细胞的主要清除者，吞噬死亡细胞后，通过其抗原提呈作用激活T细胞。抗原提呈细胞上CD80/CD86与T细胞上的CD28结合是T细胞激活所不可缺少的［2］。然而在卵巢癌研究中发现肿瘤局部及腹腔T细胞普遍存在功能缺失，对肿瘤抗原呈无反应性［3］。其具体机制目前尚不清楚。我们拟在体外研究卵巢癌细胞不同死亡形式对巨噬细胞CD80及CD86表达的影响，探讨卵巢癌局部免疫缺陷的可能机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基与胎牛血清购自Gibco BRL公司，胰蛋白酶、脂多糖（LPS）、磷脂酰丝氨酸（PS，3-sn-Phosphatidyl-L-serine from bovine brain)及磷脂酰胆碱（PC，from egg yolk)，红色细胞示踪剂PKH2-GL及绿色细胞示踪剂PKH267均购自Sigma公司，淋巴细胞分离液购自AXIS-SHIELD公司，X-vivo15培养液购自Bio Whittaker公司。抗CD80单克隆抗体及抗CD86单克隆抗体购自Ancell公司。生物素化鼠抗人SP试剂盒购自北京中山生物技术公司。
1.2 细胞及培养 （1）巨噬细胞从健康女性外周血中分离，方法如下：自中心血站采取健康献血者的外周血白细胞，用等量体积磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）对倍稀释后，缓慢加到等量淋巴细胞分离液上，室温离心2500rpm 25min，吸取单个核细胞层，用PBS反复洗2次。用X-vivo15培养液将单个核细胞配成107/ml，加入24孔板中，每孔1ml。37℃,5%CO2下培养1～2h后，以PBS冲洗两遍，洗去未贴壁细胞。加入含10%人血清（AB血型健康人外周血中分离而得）的X-vivo15培养液，37℃ 5%CO2下培养7天得巨噬细胞，约106/孔，在第3天时换液一次。（2）卵巢癌细胞系SKOV3细胞从本实验室细胞库中复苏后以RPMI 1640在37℃ 5%CO2下培养。
1.3 卵巢癌细胞凋亡、坏死的诱导及其检测 SKOV3细胞在对数生长期以紫外线灯16cm距离照射5～7min诱导凋亡，在液氮中反复速冻速融2次诱导坏死。以吖啶橙/溴乙啶染色后在荧光显微镜下检测细胞死亡形式及其百分比。活细胞核呈均匀绿染；凋亡细胞核绿染，核浓缩或边聚；坏死细胞核红染。检测结果显示，紫外线诱导凋亡率＞90%，冻融诱导坏死率＞99%。
1.4 PS脂质体及PC脂质体的制备以薄膜-超声法制备PS-脂质体及PC-脂质体，其中PS-脂质体成分为PS∶PC=3∶7，PC-脂质体单纯含PC。制成的PS-脂质体及PC-脂质体浓度均相当于500μg脂质/ml。用滤纸过滤除菌后4℃避光保存备用。
1.5 吞噬实验 活的SKOV3细胞以红色细胞膜染料PKH2-GL染色后，以上述方法诱导凋亡。凋亡的SKOV3细胞配制成5×106/ml，混合脂多糖（LPS：终浓度5μg/ml)加入巨噬细胞培养孔中，每孔1ml。24h后，PBS反复清洗培养孔去除被吞噬细胞死亡细胞。0.25%胰酶消化悬浮巨噬细胞，以绿色细胞膜染料PKH267染色。在荧光显微镜下观察，双染细胞为吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞。计数吞噬了凋亡SKOV3细胞的巨噬细胞的比率
。以同样方法观察计数吞噬了坏死SKOV3细胞的巨噬细胞的比率。
1.6 巨噬细胞CD80和CD86表达的检测 免疫细胞化学方法检测巨噬细胞CD80和CD86的表达。用PBS清洗7～9天的巨噬细胞，清除碎屑，坏死与凋亡的SKOV3细胞各配制成5×106/ml，分别混合LPS（LPS终浓度5μg/ml)加入巨噬细胞培养孔中，每孔1ml。PS脂质体与PC脂质体分别混合LPS（LPS终浓度5μg/ml)加入另外的巨噬细胞培养孔中，每孔1ml。以单纯加LPS的巨噬细胞作为对照组。作用18～20h后检测巨噬细胞CD80和CD86的表达。PBS清洗贴壁有巨噬细胞的玻片，5%戊二醛固定10min，PBS冲洗3×5min，1%过氧化氢15min，PBS冲洗3×5min,滴加一抗，4℃过夜，PBS冲洗3×5min，滴加二抗30min，PBS冲洗3×5min，滴加辣根过氧化物酶，30min后PBS冲洗3×5min，DAB显色5min，晾干、复染、封片。染色强度指数评分法［4］：强阳性：3分；阳性：2分；弱阳性：1分；阴性：0分。每张片子计数5个高倍视野，分数=5(3×强阳性百分率+2×阳性百分率+1×弱阳性百分率）/5。
1.7 统计学方法 各组数据通过正态分布及方差齐性检验，采用方差分析Dunnett法检验。检测标准为双侧α=0.05。所有数据统计采用SPSS 11.0软件完成。
2 结果
2.1 巨噬细胞对不同死亡形式卵巢癌细胞SKOV3的吞噬 在荧光显微镜下，红绿双染细胞为吞噬了死亡细胞的巨噬细胞，见图1。巨噬细胞对凋亡和坏死的卵巢癌细胞SKOV3 都能积极的吞噬，吞噬凋亡卵巢癌细胞SKOV3的巨噬细胞比率为（35.3±6.9）%，吞噬坏死的卵巢癌细胞SKOV3的巨噬细胞比率为（31.2±4.1)%。
2.2 卵巢癌细胞SKOV3不同死亡形式对巨噬细胞CD80和CD86表达的影响免疫染色以细胞膜呈棕色着色为阳性。凋亡细胞和坏死细胞作用下巨噬细胞CD80、CD86表达情况见表1、图2。统计结果显示与未加死亡细胞组相比，凋亡卵巢癌细胞对巨噬细胞CD86的表达有所抑制，但差异无显著性（P=0.141),而坏死卵巢癌细胞增强CD86的表达，差异有显著性（P=0.013）。而凋亡与坏死细胞对巨噬细胞CD80的表达无明显影响（P=0.914;P=0.377)。
表1 不同细胞死亡形式对巨噬细胞CD80和CD86表达的影响 （略）注：凋亡细胞组与对照组差异无显著性，△P＞0.05;坏死细胞组与对照组差异有显著性，★P＜0.05;坏死细胞组与对照组差异无显著性，☆P＞0.05
2.3 磷脂对巨噬细胞CD80和CD86表达的影响 含PS脂质体与PC脂质体作用下巨噬细胞CD80、CD86表达情况见表2、图2。统计结果显示与未加死亡细胞组相比，含PS脂质体与PC脂质体对巨噬细胞CD80（P=0.619;P=0.923)和CD86（P=0.414;P=0.816)的表达均无明显影响。
表2 不同脂质体对巨噬细胞CD80和CD86表达的影响 （略）注：PS组与对照组差异无显著性，△P＞0.05;PC组与对照组差异无显著性，☆P＞0.05
3 讨论
淋巴细胞的活化需要双信号系统的刺激：第一信号来自MHC-抗原肽复合物；第二信号来自抗原非特异性的协同刺激分子。在缺乏协同刺激分子的作用下，单一的抗原信号不能有效激活T淋巴细胞，却往往导致T细胞的无反应或免疫耐受。而在协同刺激分子中，CD80和CD86是目前认为最重要，也是研究的最多的协同刺激分子［2］。
在炎症的研究中显示，不同的细胞死亡形式对巨噬细胞功能有着完全不同的影响，凋亡细胞可以促使巨噬细胞炎症抑制因子的分泌，及抑制巨噬细胞促炎因子的分泌，促使炎症消散或向慢性转归，而坏死细胞则完全相反［5，6］。我们在以前的实验中已证实，不同的卵巢癌细胞死亡形式对巨噬细胞的细胞毒作用及NO的分泌有完全不同的影响（尚未发表）。在本研究中，我们进一步观察不同的卵巢癌细胞死亡形式对巨噬细胞CD80和CD86表达的影响。结果发现，被LPS激活的巨噬细胞对凋亡和坏死的卵巢癌细胞的吞噬能力相似。两种死亡形式的卵巢癌细胞对巨噬细胞CD80的表达都无明显影响。但是凋亡的卵巢癌细胞不能有效地上调巨噬细胞协同刺激分子CD86的表达，甚至有所下调。而坏死的卵巢癌细胞却能使巨噬细胞CD86的表达显著增强。CD86作为重要的协同刺激分子，将直接影响巨噬细胞的抗原提呈功能。目前应用于卵巢癌化疗的各种药物中绝大多数以诱导肿瘤细胞凋亡为终点。根据本文结果提示，由化疗药物引起的肿瘤细胞凋亡，不能像细胞坏死那样有效刺激巨噬细胞协同刺激分子表达增加，从而促进其抗原提呈功能和增加肿瘤局部免疫。相反，可能通过巨噬细胞表面协同刺激分子表达受抑制，而引起非治疗期望的结果。
对于凋亡细胞不能有效促发甚至下调巨噬细胞协同刺激分子表达的机制尚未阐明。近年来有研究显示凋亡细胞本身可以分泌一些炎症抑制因子［7］,如TGF-β、IL-10等，而且凋亡细胞也可以促使巨噬细胞分泌炎症抑制因子，这些细胞因子通过自分泌与旁分泌方式抑制巨噬细胞协同刺激分子的表达。最近有研究显示［8］，巨噬细胞吞噬凋亡细胞的DNA片断后也可以下调巨噬细CD80、CD86、ICAM及MHCⅡ等与抗原提呈有关分子的表达。另外，考虑到磷脂酰丝氨酸是凋亡细胞膜外表面上普遍存在的特征性膜分子。而在体内、外多项实验中［9，10］证明磷脂酰丝氨酸能抑制巨噬细胞的细胞毒作用，NO的分泌及一些促炎因子的分泌，起着炎症抑制作用。那么PS是否影响巨噬细胞CD80和CD86的表达呢？我们的实验结果显示，PS巨噬细胞CD80及CD86的表达都无明显影响。由此推论，凋亡细胞对巨噬细胞协同刺激分子表达的影响可能并不通过磷脂酰丝氨酸途径起作用。而对于坏死细胞对巨噬细胞协同刺激分子表达的影响机制研究甚少，可能与坏死细胞促进巨噬细胞分泌一些细胞因子有关，如TNF、IL-1等［5］。
（本文图片见附页1）
【参考文献】
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(编辑：建 伟)
作者单位： 310006 浙江杭州，浙江大学医学院附属妇产科医院肿瘤科