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【摘要】 目的 本实验用睾酮联合绒毛膜促性腺激素(HCG)及炔诺孕酮联合HCG两种方法分别建立多囊卵巢大鼠模型,将模型鼠的卵巢形态及血清激素方面改变与人类多囊卵巢综合征(PCOS)的病理改变加以比较,探讨睾酮联合HCG是否是建立多囊卵巢大鼠模型的有效方法,并比较两种造模法是否存在异同点,判断哪一种造模方法更为理想及简便有效。方法 将23日龄SD雌性大鼠随机分为3组,A组皮下注射睾酮及HCG;B组皮下包埋炔诺孕酮避孕棒后注射HCG;C组皮下注射等量生理盐水,20天后称体重,取血,处死取卵巢。用ELISA法检测血激素的改变,称卵巢重量,用光镜观察卵巢形态学改变。结果 A、B组卵巢增大，呈多囊性改变，A、B组与C组比较雄激素增高，LH/FSH增加，但A、B两组之间差异无显著性。结论 睾酮联合HCG是建立多囊卵巢大鼠模型的有效方法，与炔诺孕酮联合HCG的造模法相比更为简便可行。
【关键词】 多囊卵巢综合征；大鼠模型；睾酮联合HCG
Study of rat model with polycystic ovary induced by testosterone plus human chorionic gonadotropin
WEI Wei,SUN Lin,GUAN Yong-mei.
Department of Obstetrics and Gynecology,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China
【Abstract】 Objective To establish rat model with polycystic ovary with two different methods:testosterone(T) plus human chorionic gonadotropin (HCG) and progestogen(P) plus HCG，compare the rat models induced by testosterone plus HCG with the patients with polycystic ovary syndrome(PCOS) in the aspects of ovarial morphous and gonadal hormone,and investigate whether testosterone with HCG is the effective method to establish rat model with polycystic ovary syndrome,than compare two methods(T+HCG and P+HCG)finally to draw a conclusion if there are any difference or similary between the two methods and which one is more ideal and convenient.Methods 60 SD female rats of 23 days were divided into three groups in random.Group A:have a hypodermic injection with testosterone plus HCG;Group B:hypodermic embed progestogen contraceptive stick followed by hypodermic injection of HCG;Group C:hypodermic inject same volume of isotonic Na Chloride as control.After 20 days the blood of 60 rats were abstracted by eyeball dissection,gonadal hormone lever were tested with ELISA, then the rats were killed,the rats ovaries were dissected, morphological changes in ovaries were observed by microscopy.Results The ovaries from group A and group B were larger than those from group C and appeared a polycystic change.Testosterone concentration and the ratio of LH/FSH in group A and group B were higher than those of group C,and there was no significant difference between group A and group B.Conclusion Testosterone plus HCG is an effective method to establish polycystic ovary model in rat,furthermore it is more simple compared with the method of progestogen plus HCG.
【Key words】 polycystic ovary syndrome;rat model;progestogen plus HCG
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS)是生育年龄妇女常见的生殖内分泌疾病，该病以雄激素增高、持续性不排卵为主要特征，临床表现复杂，根据PCOS患者的临床表现、发病机制及对治疗反应的不同倾向将PCOS分为二型，即PCOSⅠ型与PCOSⅡ型［1］。近年来虽然对于PCOS研究有很大进展，但其发病机制仍不明确，临床也仅限于对症治疗，病理生理改变也存在许多问题有待解决，因此，PCOS是生殖内分泌领域研究的重点与难点。因PCOS患者多以药物治疗为主，临床病理取材较困难，因此多囊卵巢的研究多从动物模型入手，迄今为止国内外已经报道了用多种不同方法建造多囊卵巢的大鼠模型，每种方法均各有利弊，其中孕激素联合绒毛膜促性腺激素（HCG）的造模方法已有多次报道［2，3］，被证明是一种成功的大鼠多囊卵巢的造模方法。本文鉴于PCOS的主要表现为高雄激素血症及LH增高，欲探讨应用雄激素联合HCG建造多囊卵巢动物模型的可行性，并对该方法所致的大鼠血清激素和卵巢形态的改变以及造模成功率方面与孕激素联合HCG的造模方法加以比较，以期寻找一种简便易行且成功率高的造模方法。此外雄激素联合HCG造模方法的成功建立对于PCOSⅠ型与Ⅱ型病因的探讨也将有所帮助。
1 材料与方法
1.1 试剂 丙酸睾酮注射液：天津金耀氨基酸有限公司；HCG注射液：苏州新宝制药厂；左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒：上海达华制药厂；ELISA［雌二醇（E2）、孕酮（P）、睾酮（T）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）］试剂盒：天津德普生物技术公司。
1.2 动物模型的建立 选择本院动物实验中心23日龄幼年Sprague-Dawley雌性清洁、健康大鼠，体重30～35g，随机分为3组，A组（T+HCG组），B组（P+HCG组）与C组（对照组）各20只。均在21日龄断乳，喂以颗粒饲料。A组：颈背部皮下注射丙酸睾酮1.25mg/只，隔日1次，同时给予HCG 1.5u/只，每天2次皮下注射，连续20天；B组：皮下埋植炔诺孕酮硅胶棒，3mm/只，从27日龄开始每天2次皮下注射HCG 1.5u/只；C组：同期皮下注射生理盐水0.15ml/只，每天2次，共20天。
1.3 血清激素水平测定 持续给药后第21日晨称大鼠体重，摘眼球取血，以1500r/min速度离心15min，收集血清标本，-20℃储存。用ELISA法检测血E2、P、T、LH、FSH的浓度。
1.4 卵巢形态学观察 采血后将大鼠断颈处死，剖腹取卵巢，在解剖显微镜下去除卵巢表面的脂肪组织和包膜，称卵巢重量（取两侧卵巢重量的平均值）。然后将卵巢标本放入10%甲醛中固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，观察大体形态及光镜下细胞结构和形态改变。
1.5 统计学方法 实验资料为计量资料，以均数±标准差（±s）表示，采用q检验分析，多个样本均数进行多重比较。应用SAS软件进行统计。
2 结果
2.1 大鼠体重的改变 A、B、C三组之间大鼠体重差异均无显著性（P>0.05)。见表1。
2.2 大鼠卵巢的改变
2.2.1 卵巢大体解剖学改变 A组、B组卵巢体积增大，表面苍白，隐约可见包膜下扩张的卵泡；C组卵巢色泽较红，体积相对较小。三组卵巢重量的比较：A组与C组、B组与C组比较卵巢重量均增加，差异有显著性。A组与B组之间差异无显著性。见表1。
表1 三组大鼠体重及卵巢重量的比较 （略）
注：A、B组与C组比较，*P<0.05;A组与B组比较，△P>0.05
2.2.2 卵巢光镜下改变 C组卵巢镜下可见多个不同发育时期的卵泡，颗粒细胞多层，排列整齐，胞浆丰富，染色质致密，卵泡膜细胞1～2层；A组与B组卵巢内囊状扩张的卵泡增多，其卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层减少至2～3层，排列疏松，卵泡膜细胞增生。见图1、图2。
图1 A组卵巢 4×10倍（略）
图2 A组卵巢 10×10倍（略）
2.3 大鼠血清激素的改变 A组E2水平较C组低，B组与C组比较则E2水平高，三组之间差异均有显著性。B组P水平明显增高，与A组、C组差异均有显著性，而A组与C组之间差异无显著性。T水平A组、B组、C组之间差异均有显著性，A组雄激素水平最高，B组次之，C组最低。A组与B组LH均较C组有显著性增高，但两组之间差异无显著性。三组之间FSH水平差异无显著性。A组与B组LH/FSH较C组有显著性增高，但二者之间差异无显著性。见表2。
表2 3组大鼠血清激素的比较（略）
注：与C组比较，*P<0.05;A、B两组比较，△P<0.05
2.4 A组、B组造模成功率的比较 A组造模成功率90%，高于B组的75%（P<0.05)。见表3。
表3 A、B两组造模成功率比较（略）
注：与B组比较，P<0.05
3 讨论
A组与B组大鼠卵巢肉眼观察：双侧卵巢体积增大，白膜厚，凹凸不平，隐约可见白膜下多个囊性扩张的卵泡；显微镜下观察可见：卵巢皮质内囊状扩张的卵泡明显增多，窦前卵泡的数量也有所增加，其中有些卵泡内卵母细胞及透明带消失，颗粒细胞层减少，排列疏松，卵泡膜-间质细胞明显增生。说明卵泡周期中募集的卵泡数量较多但卵泡选择及优势化异常，卵泡发育成熟受阻，停留在小卵泡阶段，部分卵泡闭锁，出现颗粒细胞凋亡现象，卵母细胞消失。这些都与人类PCOS患者卵巢形态的改变相符合。
A组与B组大鼠在血清激素方面的改变：血清T水平均升高，尤以A组为著，同时此两组LH水平较对照组升高，LH/FSH比值升高，与对照组差异有显著性，而FSH水平与对照组差异无显著性，这些也与人PCOS患者血清激素的改变相似。因此说明睾酮联合HCG与孕激素联合HCG均是建立大鼠多囊卵巢病理模型的有效造模方法。
PCOS的发病机制尚不明确，但研究表明雄激素和LH的增高可能是导致多囊卵巢的原因。LH已被证实在排卵前出现的高峰可促进颗粒细胞的分化，同时抑制颗粒细胞的有丝分裂，从而限制了颗粒细胞的数量，最终导致卵泡停止发育。多数PCOS病人LH是增加的，但无法达到排卵前的高峰水平。本实验中外源性地给予HCG（LH的替代品）使LH对正在成熟过程中的卵泡的影响相当于正常月经周期中LH高峰时所发挥的作用，使颗粒细胞过早进入分化状态，导致卵泡的颗粒细胞增殖终止，因此不能排卵［4］。同时增生的卵泡膜细胞分泌雄激素可以抑制卵巢内的雌激素，造成卵泡停止发育及闭锁，闭锁的卵泡形成间质组织的一部分，使卵巢间质进一步增生，形成多囊性改变。高水平的雄激素经腺体外转化为雌酮（E1），使雌激素水平提高但无周期性变化，因此对下丘脑和垂体形成不适当的反馈，从而导致促性腺激素释放激素（GnRH)分泌频率的增加，而高频率的GnRH脉冲使垂体分泌LH的敏感性增加［5］，而FSH的释放对高频的GnRH相对不敏感，故出现垂体分泌LH、FSH敏感性的分离。现已证实LH是促进雄激素合成的重要因素，它直接激活细胞色素P450c17酶活性［6］，促进雄激素的生物合成。由此可见LH与雄激素之间二者相互影响、互为促进，形成恶性循环，进一步加重多囊卵巢卵泡生长、成熟及排卵障碍。本实验在A组大鼠中应用外源性的睾酮与HCG，模拟多囊卵巢患者体内雄激素与LH水平的增加，能够成功地诱导大鼠的卵巢发生多囊性改变，进一步证实雄激素与LH水平的异常升高是导致PCOS形成的重要机制之一。
根据PCOS患者的临床表现、发病机制及对治疗反应的不同倾向将PCOS分为二型：Ⅰ型，LH/FSH>2.5，对克罗米芬促排卵作用反应较好；Ⅱ型，LH/FSH比值不高，肥胖型，以高胰岛素血症及胰岛素抵抗（RI）为主，神经-内分泌-代谢失调明显，克罗米芬拮抗，二者均伴有高雄激素血症［1］。A组大鼠应用睾酮与HCG诱导大鼠卵巢多囊性改变，雄激素升高，但体重变化与对照组无明显差别，LH/FSH比值较对照组升高，这些都与PCOS Ⅰ型患者的病理表现相似，故高雄激素血症与LH水平升高可能是PCOS Ⅰ型的主要发病机制。
有实验表明［7，8］单独应用睾酮制作病理模型的不足之处在于无卵巢白膜增厚，体积增大，相反其体积与重量比正常卵巢减小，而且模型鼠血中LH不升反降，这些都与人PCOS的表现有差别。单独应用HCG诱导大鼠卵巢发生多囊性改变，成功率只有60%［9］。但用雄激素联合HCG建立的大鼠PCOS模型，可以克服上述的不足。
T+HCG与P+HCG两种方法均可成功建立大鼠PCOS病理模型，且二者比较在卵巢形态方面的改变差异无显著性，但A组大鼠血雄激素增加较B组大鼠显著，而且T+HCG法较P+HCG法造模成功率高，另外P+HCG法需要向大鼠皮下包埋含孕激素的避孕棒，操作相对复杂，而T+HCG只需皮下注射的方法，相对来说简便易行，便于应用推广。
临床PCOS患者主要依靠药物治疗，手术病人很少，临床病理取材很困难。理想的多囊卵巢动物模型是用来研究和探讨PCOS发病机制、病理生理改变及寻求有效治疗方法的最佳手段。雄激素联合HCG建立大鼠PCOS病理模型无论血清激素还是卵巢形态的改变都与人PCOS表现非常近似，是建立PCOS动物模型的有效方法，且简便易行，为今后进一步进行PCOS的相关研究打下良好基础并可以提供充足的病理组织来源。
（本文图片见封三）（略）
【参考文献】
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(编辑：唐 城)
作者单位： 150086 黑龙江哈尔滨，哈尔滨医科大学附属二院妇产科（*通讯作者）