新生儿CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因的多态性分析

　　【摘要】  目的  研究新生儿CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因的多态性分布，为新生儿建立相应基因型记录，达到防病治病的目的。方法  收集新生儿脐血，抽提其中有核细胞的DNA，PCR扩增CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因的特征性外显子片段。限制酶切CYP1A1扩增产物，RFLP分析每个标本的基因型；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析GSTM1、GSTT1的基因型。结果  CYP1A1、GSTM1和GSTT1基因型均呈多态性分布，CYP1A1的基因型分布有3种，分别为A/A基因型（占60.9%）、A/G基因型（占34.5%）、G/G基因型（占4.5%）；GSTM1的基因型有2种分别为GSTM1+/+和GSTM1 +/0（占85.5%）、GSTM10/0（占14.5%）；GSTT1基因型分布为GSTT1+/+和GSTT1 +/0（占76.4%），GSTT1 0/0（占23.6%）。结论  在正常出生的新生儿中，代谢酶CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因存在着多态性分布的现象。

　　【关键词】  婴儿，新生；细胞色素P450；谷胱甘肽-S-转移酶；基因
  
　　Distribution of polymorphism of infant CYP1A1，GSTM1 and GSTT1 genotypes

　　ZHOU Yi,XIONG Mi,MA Zhiming,et al.

　　Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

　　【Abstract】  Objective  To establish the genotype records for the new born infants to guide prevention and therapy of disease by investigating distribution of polymorphism of infant CYP1A1,GSTM1 and GSTT1 genotype.Methods  The DNA was extracted from new born infants cord blood.The exon 4 of GSTM1 gene,specific region of GSTT1 gene and exon 7 of CYP1A1 gene were amplified by PCR,the polymorphism of CYP1A1 gene were analyzed by PCRRFLP,the polymorphism of GSTM1 and GSTT1 gene were detected by gel eletrophoresis.Results  The genotype of CYP1A1,GSTM1,GSTT1 were polymorphic distribution in infants.There were three genotype of CYP1A1 gene according to the 4889 base A or G in exon 7 region,and A/A ratio was 60.9%,A/G ratio was 34.5%.G/G ratio was 4.5%.The two genotype of GSTM1 was GSTM1+/+(including GSTM1 +/0)and GSTM1 0/0 based on the amplified alleles deleted or not,their ratio were 85.5% and 14.5%.The genotype ratio of GSTT1 were GSTT1+/+(including GSTT +/0)76.4% and GSTT1 0/0 23.6%.Conclusion  There are polymorphic distribution of infant metabolic enzyme CYP1A1,GSTM1,GSTT1.It indicates that the varability of suffering disease may be among the individuals.

　　【Key words】  infant;Cytochrome P450;glutathione Stransferases;gene polymorphism

　　人类的许多疾病都与其自身的遗传因素有关，如视网膜母细胞瘤、家族性结肠息肉病等；甚至某些恶性肿瘤的发生也有遗传性的易感倾向［1～8］。已有研究证实，肺癌、肝癌、慢性阻塞性肺疾病等多种疾病与代谢酶细胞色素P450（Cytochrome P450,CYP450）和谷胱甘肽S转移酶（glutathione Stransferase,GST）的多态性有关［4～6］。新生儿的遗传物质受外界影响最小，基因突变的几率最小，能比较全面地反映其基因型概况。本实验用新生儿脐血中有核细胞的基因组DNA，通过PCR扩增CYP1A1、GSTT1、GSTM1的基因片段，限制性片段长度多态性（restrict fragment length polymorphism,RFLP）分析CYP1A1基因，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析GSTT1、GSTM1的基因片段多态性，为新生儿建立基因档案，进一步指导他们在以后生活中有目的地进行防病治病。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂  一次性负压自动抽血试管（武汉致远医疗器械设备有限公司），低温离心机（Sigma公司）。PTC—100型程控热循环仪（美国），超声波细胞破碎仪（美国），震荡器，恒温摇床，低温冰箱，恒压电泳仪，垂直电泳槽，EDTA，TrisCl，平衡酚，异戊醇，三氯甲烷，十二烷基磺酸钠（SDS），无水乙醇；PCR扩增缓冲液（内含15mmol/L MgCl2），Taq热聚合酶，四种寡核苷酸混合物（每种浓度均为1mmol/L），扩增基因片段的引物，限制性内切酶Ncol及其酶切缓冲液。DNA片段大小的标准参照物DNA marker pBR3220DNA/HaeⅢ、pBR322DNA/MspⅠ（华美生物工程公司）。PCR扩增缓冲液，电泳缓冲液TBE，硼酸，蔗糖二甲苯青FF，溴芬蓝，硝酸银，氢氧化钠，甲醛，硝酸，不同浓度的PBS缓冲液，过硫酸铵等。新生儿脐血110份。

　　1.2  方法

　　1.2.1  模板DNA的制备  从外周血白细胞中提取基因组DNA，具体方法：血液离心分层后，收集有核细胞成分，加细胞裂解液，细胞破碎仪15s×3次，间断破碎细胞，使白细胞充分裂解。蛋白酶K的消化缓冲液，37℃条件下2h。平衡酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提。冰冷乙醇沉淀。TE缓冲液保存。

　　1.2.2  基因片段的扩增  GSTM1外显子4部分序列（271bp）与GSTT1基因部分序列（480bp）的扩增：GSTM1基因引物为上游：5CTGCCCTACTTGATTGATGGG3；下游：5CTGGATTGTAGCAGATCATGC3。GSTT1引物为5TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3，5CAGCTGCATTTGGAAGTGCTC3。同时共扩增人体β珠蛋白基因（βglobulin）片段作为内参对照，引物为βglobulin:5CAACTTCATCCACGTTCACC3，5GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3，扩增片段大小为268bp。

　　GSTM1外显子4部分序列（271bp）与GSTT1基因部分序列（480bp）的扩增：GSTM1扩增PCR反应条件：反应体积为50μl,含10×PCR缓冲液5μl(50mmol/L KCl,10mmol/L TrisHCl,15mmol/L MgCl2），dNTP 200μmol/L，引物浓度0.3μmol/L，50ng DNA，2u的Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94℃初始变性5min后进行30次循环：95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，之后72℃延伸5min。

　　GSTT1扩增PCR反应条件：PCR反应体积为100μl，含10×PCR缓冲液10μl(50mmol/L KCl,10mmol/L TrisHCl,15mmol/L MgCl2），dNTP 200μmol/L,每条引物30pmol,50ng DNA,2u的Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94℃初始变性5min后进行29次循环：95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，之后72℃延伸5min。

　　1.2.3  CYP1A1 PCR产物的酶切  对于CYP1A1 PCR扩增产物纯化，限制酶切消化。酶切反应体系的组成：灭菌的重蒸水12.3μl,RE 10×缓冲液2.0μl，乙酰化的BSA 0.2μl(10μg/μl），PCR产物（0.2μg/μl）5μl，管内均匀混合，然后加入限制酶0.5μl(10u/μl），终体积20.0μl，震荡器上震荡5s混匀，然后离心几分钟，37℃孵育5h后，4℃冰箱储存。

　　1.2.4  电泳及分析  GSTM1、GSTT1的PCR产物用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据其条带的有无，确定其基因型；CYP1A1的产物经NcolⅠ酶消化后，10%非变性聚丙烯酰胺，RFLP分析每个标本的基因型。由于GSTM1、GSTT1单个等位基因缺失和不缺失的目的基因片段经PCR扩增后，其量已不易确定，故琼脂糖电泳的方法不能区分这两种情况，在统计时+/+和+/0记在一起。

　　2  结果

　　CYP1A1的A/A、A/G和G/G基因型频率分别为60.9%（67/110）、34.5%（38/110）和4.5%（5/110）；GSTM1的基因型有2种，分别为GSTM1+/+和GSTM1+/0占85.5%（94/110）、GSTM1 0/0占14.5%（16/110）。GSTT1基因型分布为GSTT1+/+和GSTT1+/0占76.4%（84/110），GSTT1 0/0为23.6%（26/110）。见表1。表1  新生儿代谢酶CYP1A1、GSTM1、GSTT1的基因型分布 

　　3  讨论

　　细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)酶是由其相应基因编码的超家族酶系，广泛存在于人体的各种组织中，为外源性化合物在体内代谢的Ⅰ相酶，主要参与把疏电子的、非活性基团的化合物转变成亲电子的、带有活性基团的化合物的过程。CYP多数成员的某些等位基因存在多态性的变异体，这些变异体基因所编码酶的代谢活性相差数十至数百倍，这种遗传性的差异在人群的自然发病方面有重要意义。人类的CYP1A1是一个CYP的亚家族；它位于第15对染色体的短臂上，有7个外显子，主要编码多环芳烃诱导的芳香烃羟化酶。该酶高度保守，主要参与烟草中前致癌物的代谢，如激活存在于多种上皮组织中的PAHs和芳香胺。CYP1A1的诱导作用可以被芳香族诱导复合体与芳香烃受体的特异性结合所引发，芳香烃转位体基因进一步参与CYP1A1的诱导通路。但迄今尚没发现芳香烃受体多态性和肺癌风险之间的关系。CYP1A1多态性位点有两个，一是MspⅠ酶切位点的突变（m1)，增加酶的催化活性；二是CYP1A1基因第7外显子A、G碱基的互换使与血红蛋白结合区异亮氨酸变为缬氨酸（m2），改变了蛋白质的折叠，增加乙氧基-0-脱乙烷酶的活性，也有可能与其他功能性的多态性连锁在一起起作用。吸烟人群中，异亮氨酸-缬氨酸突变型携带者白细胞中的PAHDNA加合物比非携带者多［7］；在具有MspⅠ酶切位点多态性的新生儿脐血和胎盘组织中也发现这些加合物的升高［8］。

　　致癌物代谢的Ⅰ相酶和Ⅱ相酶之间相互作用。在人类的细胞中CYP1A1基因型与GSTM1 0/0之间相互作用增加DNA损伤和患肿瘤的风险，GSTM1基因缺失与2，4，7，8-四氯二苯对二氧化物强诱导的CYP1A1的转录有关。检测吸烟者肺组织加合物时发现GSTM1缺乏的表现型与CYP1A1的高诱导性或CYP1A1的等位基因的变异体之间的相互作用，可以导致具有CYP1A1/MspⅠ/MspⅠGSTM1 0/0基因型的高加索人加合物水平很高。也有报道CYP1A1（m2 or ml）/GSTM1 0/0基因型在肺鳞状细胞癌的发生中有重要意义［9］。我国学者对江苏人群CYP1A1和GSTM1基因多态性的个体肺癌易感性的研究中发现，CYP1A1异亮氨酸/缬氨酸或CYP1A1缬氨酸/缬氨酸基因型与GSTM1基因缺失型的个体患肺癌的风险增加［10］。

　　GSTs家族是人体内参与生物代谢的二相酶系，把活泼带电子的有致癌能力的化合物转化为灭活、无致癌活性的无毒物质后经其他途径排出体外，在人体的生物代谢中起着重要的作用。GSTM1与GSTT1基因属于GSTs基因家族成员，分别定位于染色体1p13.3、22q11.2区［11］，GSTM1与GSTT1纯合性缺失基因型可导致其产物GSTM1Ⅰ和GSTT1Ⅰ酶蛋白的表达缺失从而使其对外界的某些致癌物（如多环芳烃化合物）解毒作用缺陷。研究表明，GSTM1与GSTT1基因的纯合性缺失与某些肿瘤，如肺癌、乳腺癌等的发生相关［12，13］。

　　人的基因型是重要的遗传标志，在其一生中参与生命活动的生物大分子都是有明确基因编码的，不同基因型个体体内的功能性蛋白质分子差异很大，可表现为对某些疾病的易感性不同，因而相同生活环境下的人群中，某些疾病的发生存在着明显的个体差异。本实验通过检查新生儿代谢酶CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因型，建立人个体的基因型档案，对指导不同基因型人个体的一生中的防病和治病有重要的意义。

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　　作者单位： 1 430030 湖北武汉，华中科技大学同济医学院

　　2 710077 陕西西安，西安外事学院医学院