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【摘要】 目的 探讨米非司酮药物流产后子宫出血与uNK细胞的关系。方法 选取自愿终止妊娠的停经8周之内的早孕妇女，自愿选择药物流产或人工流产两种方法，分为负压吸引人工流产组、药流不完全组（出血组）、药流完全组。收集3组蜕膜组织进行福尔马林固定，石蜡包埋，uNK细胞的表达采用免疫组化染色，图像分析仪定量分析。结果 米非司酮药流不完全出血区uNK细胞的数量多于药流不完全非出血区、药流完全组及人流组，差异具有统计学意义（P<0.05）。药流完全组uNK细胞的数量多于人流组，两者之间差异有非常显著性（P<0.01）。结论 米非司酮的作用可以使uNK细胞数量异常增多，使子宫局部微环境发生改变，导致异常血管生成，孕囊与蜕膜剥离不全，从而引起出血。
【关键词】 米非司酮；子宫出血；子宫内膜自然杀伤细胞
子宫内膜自然杀伤细胞（uNK细胞）是最丰富的蜕膜淋巴细胞，光镜下细胞内有大量的颗粒样结构，因此又称为大颗粒淋巴细胞。在啮齿类动物中该类细胞称为颗粒子宫腺细胞。uNK细胞存在于人类子宫内膜分泌期及早孕期蜕膜中，且与外周血的NK细胞不同，其表面标志为CD56+、CD16-［1］。近年的研究发现uNK细胞与异常内膜血管生成有关［2］。以往对于米非司酮药流后子宫出血机制的研究主要局限于子宫内膜血管生理及病理机制的研究，本项研究通过观察蜕膜uNK细胞数量的变化，来试图探讨uNK细胞与米非司酮药流后子宫出血的关系，为临床的防治提供理论依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象 年龄18~40岁，停经8周以内，经临床检查、尿HCG及B超证实为早期宫内妊娠，自愿选择药物流产或吸宫流产终止妊娠的健康妇女60例。流产前采集病史,包括年龄、孕产次、停经天数，并进行妇科检查及血常规、B超检查。药流方法为空腹口服米非司酮，晨50mg，晚25mg，共2天，总量150mg，于第3日晨口服米索前列醇600μg，并随诊。
1.2 标本采集
1.2.1 人工流产组 20例，常规负压吸引人工流产，选取吸出物中的蜕膜组织。
1.2.2 药物流产完全组 20例，收集服米索前列醇后当天及2天内排出的胎囊及蜕膜组织。经随诊月经正常来潮。
1.2.3 药物流产不全组 20例，药物流产后阴道出血持续超过2周以上，临床及B超示宫腔残留，行清宫术，留取手术刮出标本。
1.3 研究方法 活检组织入10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚5μm，进行苏木精-伊红染色和免疫组织化学检测。
1.3.1 免疫组织化学检测 切片经二甲苯脱蜡，酒精下行脱水；磷酸缓冲液（PBS，pH 7.6）清洗，应用过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）试剂盒(购自北京中杉公司)进行免疫组织化学检测。3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶（室温10min）；PBS清洗后，入0.01M枸橼酸盐缓冲液中煮沸10min进行抗原热修复；PBS清洗后，正常山羊血清抑制胶原和结缔组织非特异性反应（室温20min）；滴加一抗即鼠抗人CD56单克隆抗体（购自美国NEOMARKERS公司）4℃过夜；PBS清洗，滴加生物素化二抗反应，37℃孵育20min；PBS清洗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素（37℃，20min），DAB显色10min；脱水透明封片。
1.3.2 图像分析仪定量分析 使用LEICAQ5001自动图像分析仪对蜕膜组织中的CD56+进行定量分析。每一标本随机取10个高倍视野，分别记数其中的阳性细胞数，求出平均值。
1.4 统计学方法 所得结果用SPSS 10.0软件进行统计学处理，采用单因素方差检验和q检验。
2 结果
2.1 uNK细胞的分布 CD56+在uNK细胞的细胞膜及胞浆内表达，阳性表达物呈深棕色颗粒状。CD56+阳性的uNK细胞主要分布于各组子宫内膜的基质、子宫腺和螺旋动脉附近，呈散在分布（见图1～4）。
图1 －图4 略
2.2 药流不全出血区、药流不全非出血区、药流完全组及人流组子宫内膜中uNK细胞的数量变化 结果见表1。米非司酮药流不完全出血区uNK细胞的数量多于药流不完全非出血区、药流完全组及人流组，具有统计学意义（P<0.05）。药流完全组uNK细胞的数量多于人流组，具有统计学意义（P<0.01）。
表1 药流不全出血区、药流不全非出血区、药流完全组及人流组uNK细胞的数量 （略）
3 讨论
妊娠胚胎是一种半同种异体抗原,妊娠是否成功与孕妇机体的免疫状况有关,特别是与子宫局部状况有关。蜕膜是最直接与胚胎接触的母体组织,早孕时蜕膜部位出现大量免疫细胞,目前最引人注目的是NK细胞。有文献报道［3］在正常的早孕蜕膜中发现大量淋巴细胞,特别是NK细胞,且NK细胞与原因不明性流产关系密切。但是NK细胞本身及它以自分泌和旁分泌形式分泌LIF、IFNγ、TNFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3以及M-CSF等与生殖有密切关系的细胞因子又具有促进滋养细胞生长,有助于孕卵着床,防止病毒垂直传播的作用［4］。正常妊娠时,NK细胞及淋巴细胞对胚胎的双重作用处于一种平衡状态,这种平衡倾向于使子宫免疫微环境有利用胚胎的免疫营养作用,任何因素破坏了这种平衡,均可激发子宫局部的NK细胞及T淋巴细胞的活性,使其免疫杀伤作用增强,表现为免疫排斥作用而导致流产的发生。
在正常月经周期中，uNK细胞于分泌期数量迅速增加，而在月经期前出现凋亡，表明uNK细胞对月经周期中子宫内膜的更新、分化以及崩溃有重要作用。体外培养发现，uNK细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）、胎盘生长因子（PGF）及血管生成素（Ang），这些细胞因子能够影响血管的稳定［5］。从蜕膜中分离出来的一种NK细胞源性的融解因子NKG5能够促进内皮细胞的有丝分裂。并且在具有蜕膜的NK细胞的条件培养基中,能够抑制人脐静脉内皮细胞的细胞凋亡［6］。这进一步表明,子宫NK细胞在血管发生及再生过程中起重要作用。
米非司酮作为孕激素的拮抗剂，在血中达到一定浓度后，可与内源性孕激素（P）竞争孕激素受体(PR)，使蜕膜组织得不到P的支持。正常妊娠时P可抑制母体对胚胎的免疫排斥反应［7］，其免疫调节作用是通过孕酮诱导的封闭因子（PIBF）来实现的。封闭因子能抑制NK细胞的活性，对维持妊娠具有重要作用［8］。Ashkar［2］等研究提示，uNK细胞在孕期的作用可能是使淋巴细胞聚集于子宫动静脉的出口处，促进基质细胞蜕膜化，同时促进怀孕导致的螺旋动脉重塑高峰的到来。本实验结果表明，米非司酮药物流产不全出血组uNK细胞数量明显多于药流完全组及人流组，且具有显著性意义（P<0.05）。米非司酮的作用可提高uNK细胞的活性，使子宫局部微环境发生改变，最终导致流产的发生。药流出血组子宫uNK细胞的数量明显多于其他组，其所分泌的细胞因子促进血管的异常生成，使得蜕膜脱落不完全，最终导致子宫出血的发生。
（本文图片略）
【参考文献】
1 赵伟秀,林其德.蜕膜大颗粒淋巴细胞与妊娠.中华妇产科杂志,1997,32（3）:187-189.
2 Ashkar AA,Croy BA. Function of uterine natural killer cells are mediated by interferon-γ during murine pregnancy. Semin Immunol,2001,13(4):235-241.
3 Dosiou Chrysoula,Giudice LC. Natural killer cells in pregnancy and recurrent pregnancy loss: endocrine and immunologic perspectives. Endoer Rev,2005,26(1):44-62.
4 Moffett-king A. Natural killer cells and pregnancy. Nat Rev Immunol,2002,2(9):656-663.
5 Trundley S,Moffett A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens,2004,63(1):1-12.
6 Li XF,Chamock-Jones DS,Zhang E,et al. Angiogenic growth factor messenger ribonucleic acids in uterine natural killer cells. J Clin Endocrinol Metab,2001,86(4):1823-1834.
7 Chantakru S,Miller C. Contributions from self-renewal and trafficking to the uterine NK cell population of early pregnancy. Journal of Immunol,2002,53:241-256.
8 Szekeres-Bartho J,Par G,Dombay GY. The antiabortive effect of progesterone-induced blocking factor in mice is manifested by modulating NK activity. Cell Immunol,1997,177(1):194-199.
基金项目：北京市优秀人才培养专项资助（20042D0501819）、北京市留学人员科技活动择优资助以及首都医科大学校重点基金资助
作者单位： 1 100069 北京，首都医科大学生殖医学研究中心，组织胚胎学教研室
2 100038 北京，首都医科大学附属复兴医院妇科
(编辑：陆 淼)