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【关键词】 早孕因子
早孕因子（early pregnancy factor,EPF）是存在于妊娠早期母体血清中的一种免疫抑制因子，被认为是热休克蛋白家族成员伴侣蛋白10（Cpn10）的同系物，在细胞外发挥效应，具有免疫抑制和生长因子的作用，嗣后发现它还对损伤修复过程及一些恶性肿瘤的生长起到支持作用。可用玫瑰花环抑制试验（RIT）做生物学鉴定。但由于其检测方法RIT的复杂性及检测效率低等问题，EPF的应用受到了极大限制。近年随着单克隆抗体（McAb）技术的不断进展，EPF的检验不仅可作为人类及家畜超早期妊娠诊断的指标，而且对预测流产和早期胚胎死亡，迅速鉴定胚胎移植效果以及尽早评价公畜的繁殖能力都有重要意义。并且EPF对于预测早期胚胎发育情况，帮助了解妊娠母体对胚胎的识别、免疫耐受和受精检测等机制提供了可能。我们希望能够制备出EPF特异性McAb，用于超早孕诊断，以及流产和某些恶性肿瘤的早期诊断及预后判断。
1早孕因子的来源
长期以来，人们对EPF的来源及结构做了多方面的研究，认为有一种卵因子在受精后开始诱导产生EPF。Lash等［1］在不同体外条件如:胚胎培养基（ECM）、血小板激活因子（PAF）及皮质颗粒释放培养基（CGRM）下刺激动情期小鼠的卵巢及输卵管以观察是否有EPF的产生，并用RIT检测，结果发现三种情况均可检测到EPF活性，该作用可完全被BN52021（一种PAF拮抗剂）阻断，认为PAF即系这种由受精卵释放的促使EPF合成起始的卵因子。他们还发现，卵巢对上述三种刺激均有反应，而输卵管则无，表明了卵巢是产生EPF的最初场所。EPF的产生具有两个阶段也是人们所共同支持的观点，第一阶段为着床前期，为了确定第二阶段是在着床时还是在囊胚期，Lash等［2］利用红鹿受精卵在输卵管内转运时间较长这一特性，通过监测其血清内EPF活性变化，证实EPF的合成与囊胚形成密切相关。Ito等［3］对胎牛、小牛、动情期牛及妊娠期牛血清与体外受精的牛卵细胞进行共培养，用RIT检测EPF活性，结果显示EPF活性来源于受精卵细胞。Aranha等［4］以35S-蛋氨酸标记从孕母体内获取的淋巴细胞并培养使其增生，发现在妊娠期间淋巴细胞内蛋白合成增加，经检测发现其中一种具有EPF活性的分子。实验组35S-蛋氨酸在淋巴细胞中含量明显高于对照组，且在妊娠前两个阶段呈逐渐增高的趋势，在妊娠晚期降到接近对照组的水平。表明EPF有可能来源于孕妇外周血的淋巴细胞。有学者利用类固醇激素诱导培养动情期小鼠卵巢及输卵管检测是否有EPF合成，以探知卵巢激素对EPF合成的重要意义。发现在17β-雌二醇、孕激素及睾酮存在条件下对动情期小鼠卵巢及输卵管进行培养，无EPF合成，而在ECM及PAF条件下培养经17β-雌二醇、孕激素二者预处理的相同组织则可检测到EPF活性，证实EPF的合成起始主要依赖于一个合适的激素环境［5］。
2早孕因子分泌机制和作用机制
2.1分泌机制关于EPF的分泌机制已报道了几种假设，其中以Lash等及Orozco等的研究最为权威。Lash等［6］在不同体外条件如胚胎培养基（ECM）、血小板激活因子（PAF）及皮质颗粒释放培养基（CGRM）下刺激动情期小鼠的卵巢及输卵管时，结果发现三种情况均可检测到EPF活性，该作用可完全被BN52021（一种PAF 拮抗剂） 阻断，认为PAF即是这种由受精卵释放的促使EPF合成起始的“卵因子”。他们还发现，卵巢对上述三种刺激均有反应，而输卵管则无，表明了卵巢是产生EPF的最初场所。Orozco等［7］给成年雌鼠注射合成的PAF，1 h内动物血清表现出EPF活性，推测源于胚胎的PAF可能就是触发着床前产生血清EPF的动因。而在ECM及PAF条件下培养经17β-雌二醇、孕激素二者预处理的相同组织，可检测到EPF活性，证实EPF的合成起始主要依赖于一个合适的激素环境。妊娠时产生的EPF的来源不同，早期EPF（母体EPF）系在植入（pre-implantation） 及围植入（peri-implantation）时产生，而晚期（胎儿性EPF）则自围植入期开始一直持续至妊娠中期，但对附植前血清EPF的体内来源说法不一，而普遍认为EPF的产生与卵巢、输卵管、受精卵、胎盘、垂体等有关。
2.2作用机制在EPF作用机制的研究中，科学家们也做出了许多成绩。EPF通过至少两种淋巴因子EPF-S1和EPF-S2的调节发挥作用，前者是受主要组织相容性复合物（MHC）限制的，后者不受MHC的限制，并且已经分离纯化出EPF-S1的类似物，具有生物活性，EPF-S1可诱导产生EPF-S2。现在普遍认为EPF是热休克蛋白家族成员伴侣蛋白10（Cpn10）的同系物，但Somodevilla Torres等［8］证实Cpn10和EPF在作用机制上有区别。在Lewis鼠的皮肤移植实验中，在移植部位注射rEPF后，能延长皮肤的存活时间，表明EPF具有免疫抑制的调节作用，抑制了机体的免疫排斥作用［9］。Zhang等用rEPF处理患有脑脊髓炎（exper imental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的小鼠，进行分析检测，发现EPF抑制了细胞调节的免疫反应，并可减少中枢神经系统的淋巴细胞和巨噬细胞，提出EPF可呈剂量依赖性地抑制混合淋巴细胞反应（MLR）的识别相，EPF也可诱导非黏附性的Thy12+ 、Lyt- 、Lyt2+调节细胞（即抑制细胞），EPF的免疫效应不受MHC所限制，小鼠在胚胎植入前给予抗EPF抗体，可减少植入数，提示EPF在生殖过程的这一阶段具有重要意义。EPF有调节CD4+T细胞依赖的免疫反应作用［10，11］，抗CD4+能抑制绵羊红细胞和其在T细胞上受体的相互作用，EPF是通过抗CD4+来发挥其抑制作用的。在小鼠实验中表明它具有抑制迟发型过敏反应，并发现它会对一些淋巴细胞有约束作用，推测它通过约束CD4+T细胞来发挥作用。经分离T细胞和单核细胞，并用EPF标记，发现EPF会约束CD4+、CD8+、CD14+和CD56+NK细胞，但是EPF作用的细胞表面分子仍没有研究清楚。
3早孕因子的生物学作用
3.1在生长调节中的作用在发现肿瘤细胞也可产生EPF后，人们就推测EPF可能与细胞分裂有关，有促进细胞生长的功能。有以下几方面的研究结果来验证这一观点:（1）在体外培养肿瘤细胞系，发现肿瘤细胞可分泌EPF，并与细胞生长时相有关，细胞停止增殖，进入分化阶段时，产生的EPF明显减少。当肿瘤细胞与不同浓度的EPF单克隆抗体共同培养时，细胞的存活率随抗体浓度增加而降低。同一研究还证实了EPF可与淋巴细胞相互作用，激活免疫抑制因子，抑制免疫。因此肿瘤的发生可能是EPF免疫抑制和生长调节活性共同作用的结果。（2）在维持胚胎活性中的作用。Athanasas Platsis等［12］通过小鼠体内实验发现，在受精后第3天，使用EPF抗体的所有小鼠中，体内的胚胎没发生同样情况。近期，同一研究小组还发现在胚胎植入前期对母鼠使EPF抗体可导致植入失败，且胚泡滋养层细胞生长明显受到抑制［13］。（3）1994年Ouinn等［14］在小鼠进行肝脏部分切除术8 h后的血清中检测到EPF，术后48 h达到高峰。如果术后18 h用抗体主动免疫小鼠，结果残余肝脏对〔3H〕胸苷的摄取量明显下降，说明在肝细胞增生期间，EPF对DNA合成和细胞分裂很重要。这些证据提示，EPF可能是通过自分泌或旁分泌方式产生的一种生长因子，并且参与正常细胞的增殖过程。然而有关其发挥调节生长功能机制的研究还未见报道。
3.2在生殖免疫学中的意义邓松华等［15］为探讨EPF活性物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及其在胎母免疫中的作用，用淋巴细胞转化法观察EPF对后者的作用，结果发现它能抑制淋巴细胞DNA合成，即抑制它的增殖，并呈一定剂量依赖性。根据近年来的文献报道，其作用机制主要有以下几方面:（1）EPF直接抑制淋巴细胞DNA的合成。（2）EPF结合在淋巴细胞上，刺激它产生可溶性抑制因子。其中的两种已被初步认识，分别命名为EPF-S1T和EPF-S2。（3）EPF可抑制某些细胞因子的产生。IL-2主要由CD4+和CD8+细胞产生，可促进淋巴细胞的增殖与分化，是机体免疫网络中重要的细胞因子，因此IL-2的检测已成为评价机体免疫功能状态的指标之一［9］。体外实验，EPF能抑制IL-2产生，且抗胸腺细胞球蛋白（ATG）能增强这种抑制作用。IL-2活性水平的降低可能参与EPF对淋巴细胞增殖的抑制作用［16］。（4）黏附分子的表达下降。2000年，Zhang等［17］用rEPF治疗Lewis小鼠的多发性硬化症的动物模型（EAE），可缓解其临床症状。随后的研究发现，用rEPF治疗与用Vehicle治疗相比，脊髓实质中CD4+与CD8+细胞滴度降低;用rEPF治疗后，中枢神经系统中的白细胞相关功能抗原-1（LFA-1），血管黏附分子-4（VLT-4）和Ⅲ型补体受体（Mac-1）以及免疫球蛋白超家族中的粘连分子细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1）都受到抑制。这些黏附分子的减少使T细胞激活失去了必要的协同刺激信号，影响了淋巴细胞的增殖。Igarashi［18］对早孕因子对生殖免疫的作用总结为: （1）EPF可剂量依赖性地抑制混合淋巴细胞反应（MLR）的识别相。（2）EPF可诱导非黏附性的Thy12+ 、Lyt-、Lyt2+调节细胞，即抑制细胞。（3）EPF的免疫效应不受主要组织相容性复合物（MHC）所限制。（4）小鼠在胚胎植入前给予抗EPF抗体，可减少植入数，提示EPF在生殖过程的这一阶段具有重要意义。
3.3作为肿瘤鉴别Mehta等［19］报道患滋养细胞肿瘤的孕妇血清中可检出EPF样活性物质，进一步发现仅在绒毛膜癌患者血清中可检测出，而葡萄胎患者血清中却未测出，提示检测EPF有助于鉴别葡萄胎及绒癌。Rolfe等［20］报道睾丸生殖细胞肿瘤患者血清中可测出EPF或EPF样活性物（tEPF），而健康男性对照者均未测出。由此看来，EPF并非孕妇特有，即某些生殖细胞肿瘤患者血清中亦存在。
4早孕因子的检测与分离
4.1检测EPF的检出是用抗淋巴球血清（ALS）的RIT，其含量用RIT值的高低来衡量。
4.1.1原理在补体存在下，淋巴细胞可与异源红细胞形成玫瑰花环。而ALS能够抑制花环的形成。当加入ALS后花环的形成数是未加ALS的75％时，ALS的最高稀释倍数的倒数×10-8取以2为底的对数所得值即RIT。EPF能抑制玫瑰花环的形成，故被检样品中含有EPF就能减少ALS的量而形成同样多的花环，即RIT增高。EPF含量越多，RIT值也越高。一般，RIT>12者为EPF阳性，RIT<12者为EPF阴性。依此原理可以检测孕畜和未孕畜血清或组织中的EPF。
4.1.2玫瑰花环抑制试验的可靠性在用花环抑制试验检测EPF时，只有T细胞的某一亚群预先不经处理，添加红细胞后立即形成的自然花环（Ea花环）才有意义。但这一亚群淋巴细胞占T细胞总数较低，猪中约为10％。虽然用物理或化学的方法可以提高花环形成率，但经处理的淋巴细胞在检测EPF时没有意义。许多物质，如免疫抑制药物、精浆、HCG、甲胎蛋白和巨球蛋白等均能抑制自然花环的形成。此外，能破坏淋巴细胞形态和代谢完整性的制剂如神经氨酸盐、三氢化合物、肝素、去污剂等，甚至在有Ca2+、Mg2+等无机离子存在时，都能影响此测定系统的准确性。Koch等（1985）对以前测定EPF的方法稍加改进测定猪的EPF，假阳性率为8.9％，假阴性率为12.5％。Morton等采集怀孕1个月的绵羊40个样品，只有来自同一只羊的两个样品EPF呈假阴性，而未孕羊的所有样品RIT值都在未孕范围内。一般说来，花环抑制试验分析未孕血清比怀孕血清更为可靠。测未孕血清时重复性较好，批内变异系数为6.8％，而测怀孕血清时重复性较差，批内变异系数为23.8％。在用花抑制试验测定EPF时，用单克隆抗体替代ALS有望对此法做一改进，可以比较不同实验室的结果。因EPF无种属特异性，测定系统可通用。
4.2分离到目前为止，已做了试图将母体和胎儿EPF分离的各种试验。Clarke等（1982）和Wilson（1983）将妊娠母羊血清作材料，用离子交换和凝胶层析分离，得到分子量为20 000和67 000的多肽，分子量为20 000的物质是胎儿（后期）EPF活性高的部分。为分离母体（早期）的EPF，Cavanach培养液中培养5天，从培养基中分离到分子量为21 000的EPF，此物质中90％具有生物活性。这些来自母体EPF与胎儿EPF和来自肿瘤的某些物质具有相似性质，分子量20 000~21 000，并具有相互的免疫交叉反应；但在化学性质方面有些差异，用40％的硫酸铵可将母体 EPF分为两部分，而胎儿EPF和来自肿瘤的物质却不能被分离。母体EPF用硫酸铵分离时，可得到分子量大约为10 000的物质，它本身并无EPF作用，但将它的溶解性成分加到EPF-B中或将沉淀部分加到EPF-A中，又可恢复EPF的作用。EPF与蛋白质受体的结合能力也有差异。受精后数日内，从各种动物得到的EPF活性部分能与蛋白质受体结合，而妊娠末期（胎儿性的）EPF则不能与蛋白质受体结合。因此，受精后2~3日产生的EPF大部分与蛋白质受体一起存在于血液循环中；妊娠中期由于胎儿组织的原因，产生的EPF仅在胎盘等局部组织起作用。
5早孕因子的应用及前景
5.1在母体妊娠方面的应用Morton等［21］发现EPF对妊娠具有很高的特异性，并发现在所有物种中，有2/3的妊娠母体体内，EPF 是最早确认妊娠的生化标志之一，它可作为人类及家畜超早期妊娠诊断的指标，而胎儿在母体内不被当做异体抗原而受到免疫排斥，这一特殊的免疫抑制现象是由EPF的免疫调节作用决定的。从受精开始，到妊娠中期，EPF在人类及家畜母体内都会发挥作用，并出现生物活性的变化，它可以用于预测早期胚胎死亡和流产，鉴定胚胎移植效果以及尽早评价公畜的繁殖能力等方面［22］，因而EPF研究已成为生殖免疫学中的一个热点。由于EPF的生物学与免疫学性质不同于已知的妊娠相关蛋白，因此人们对其在临床上的应用发生了极大兴趣。研究表明，小鼠交配后6 h，兔交配后16 h，大鼠、绵羊、牛、猪、母羊交配后24 h，人性交后48 h 即可从母体内测出EPF［22］，远早于HCG测定，而且EPF的活性在妊娠期存在时间比较长，在小鼠可持续至产仔前4天;在人持续至妊娠6个月;绵羊、猪几乎持续整个孕期，并且发现猪的特点是怀孕3～4周时EPF活性最高，但卵子如不受精则测不出EPF［21］。利用RIT实验对EPF的活性检测可用于牛、马的早期妊娠诊断［22，23］。EPF 在孕妇的血液检测可用于超早孕诊断，准确率达88.6 %［17］，EPF作为早孕诊断的应用将对人类及家畜有重要的意义。除了早孕诊断外，还可用于检测人工授精、胚胎移植是否失败，监测妊娠母体的胎儿状态等。研究发现在胚胎移植后的12 h，血清中出现EPF，在胚胎死亡或胚胎采出24～48 h内，EPF即消失［24］。通过体外实验发现，孕血中的EPF可能促进体外受精的牛胚胎的生长发育，并且在人、小鼠的2-细胞期、原核期胚胎体外培养时可测出有EPF活性物质。在体外受精进行胚胎移植时测定EPF的RIT值有助于判断胚胎是否移植成功且能持续妊娠，也能帮助分析移植入子宫腔内的胚胎只能存活至围植入期、转移后未成活等现象［25］。通过RIT实验测定EPF的活性，可以监测母马的胚胎发育情况及胚胎早期死亡的判定［26］。测定EPF还有助于发现早期的胚胎丢失，在舒经酚处理的孕妇妊娠中，通过EPF活性的检测可以判断临床症状不显的胚胎丢失［27］。另外，早孕因子可作为屡配不孕动物胚胎早期消失的标志，在胎生动物的繁殖中，受精和附植过程非常重要，通过超声波扫描和孕酮水平测定来区分牛受精失败和胚胎早期消失是不可能的，经常有胎儿损失。因为早孕因子是妊娠依赖性的，当精子穿透卵子形成受精卵后，受精卵开始分泌早孕因子释放因子（卵因子），卵巢在该因子的作用下分泌早孕因子，早孕因子释放因子的分泌及分泌量代表胚胎的形成及在子宫内的生长状态，而早孕因子的分泌受早孕因子释放因子正反馈调节，其分泌量与早孕因子释放因子的分泌量呈正相关［28］，血清中早孕因子的RIT值可用于预测胚胎的形成及生长状态［24］。另外，EPF的测定还有助于阐明宫内节育器的“节育”机制，EPF也可作为区分不育是由于胚胎植入障碍，还是卵子根本未能受精所致;检测死胎及流产;还可用来鉴别绒癌和葡萄胎［29］。
5.2其他方面的应用EPF的作用不仅限于妊娠，它也是原发性增生细胞及肿瘤细胞产物，在损伤修复中起到一定的作用，可用于某些恶性肿瘤的早期诊断及预后判断。目前认为通过测定EPF的RIT值，可以诊断恶性的滋养层肿瘤，判定它的治疗情况，也可区别良性和恶性滋养层肿瘤［30］。已发现EPF可能使机体更容易接受肿瘤细胞，在这个方面，EPF的抗剂将有重要的治疗效果。研究发现孕血清中的EPF与生殖细胞、肿瘤患者血清中的tEPF在理化性质方面存在一定差异，但都具有类似的分子构型和交叉免疫反应。因此，从孕血清中纯化的EPF抗原所制备的单克隆抗体，通过免疫技术来测定肿瘤患者血清中的tEPF，从理论上讲也是可行的，进一步的研究尚待深入。还有学者通过对EPF的活性的分析，希望能用于组织器官移植机制的研究、效果分析及患者血液检测等领域。随着单克隆抗体的应用，使EPF作为一种抗原被检测，尽管EPF是部分纯化，但足以生产仅中和EPF的抗体，在单克隆抗体检测EPF的试验中，可以检测各种生物不同状态下的EPF［21］，这是EPF研究中的一个转折点。同时，EPF作为一种生长因子，也有其应用的可能性。但目前经常采用的玫瑰花环抑制试验只能检出EPF的免疫抑制活性，而不能检出其具体物质，此法繁琐，耗时较长，易受环境因素及实验条件等的影响，同时EPF测试时的敏感度随动物不同而异，这些限制了它的应用，所以还不能作为常规方法在生产实践中广泛应用，因而急需寻求一种简便、特异、敏感的方法检测EPF。在检测EPF的方法学上近年来有了一些改进，如免疫分析等。由于绝大多数哺乳动物中的EPF在其抗原决定簇上具有相同性，因此，在开发应用上具有广阔的前景，希望能够制备EPF-McAb及经某些酶或荧光标记后，可以达到高效的EPF检测，应用于超早孕诊断，滋养细胞肿瘤诊断等。有学者提出应用单克隆抗体代替ALS［31］，如用抗人T细胞及抗小鼠Thy1单克隆抗体、抗Hu-lyt3、全T细胞抗体等;用小鼠淋巴细胞及抗小鼠淋巴细胞血清来检测孕妇血清中的EPF。并且用纯化的EPF抗原，可以制备分泌高效价、高特异性EPF-McAb的杂交瘤细胞系，但纯化的EPF来源十分有限，采用微量抗原制备抗体技术于单克隆抗体的制备中，解决了抗原不足这一难题，使每免疫一只小鼠只需要4 pg的EPF，比传统的采用免疫佐剂皮下或腹腔注射的方法节省抗原，从而使EPF-McAb的制备成为现实。2株单克隆抗体中1B6的相对亲和力明显强于2F10，因此应用EPF-McAb，并选用相对亲和力较强的一株（1B6），可建立ELISA、免疫荧光等检测方法，用以诊断受精卵着床前的早孕情况、估计早期胚胎是否存活、判断先兆流产及其预后等，进一步研究尚待深入。同时EPF的应用前景也要受EPF分子特性的准确性判断的制约，现在发现有许多物质单独或以某种组合来做RIA时，具有抑制花环形成的能力，虽然不能说它们中的某一个或者某些是否属于EPF，但是它们确实具有类似于EPF的活性，比如花生四烯酸，白细胞三烯中的C4、D4、E4成分，以及S2因子，而分子组合则包括PAF与硫氧环蛋白（TRX）、普通血清与TRX、PAF与动情期小鼠血清等，它们组合起来亦具有花环抑制活性，如果能够确定EPF的化学结构，进而实现人工合成，就有希望将玫瑰花环抑制试验发展成为放射免疫分析或放射受体分析法，就会有力地推动EPF的研究进程，加快EPF实际应用的步伐。
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作者单位：100094 北京，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所（△通讯作者）