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【摘要】 改善恶性肿瘤预后最有效的方法就是早期诊断。近年来在传统宫颈细胞筛查的基础上，液基薄层制片、计算机辅助阅片和病因学（人类乳头瘤病毒高危型）检测等新技术逐步发展和完善，大大降低了筛查的假阴性率。使世界范围内宫颈癌的发病率和病死率显著降低。临床上已经被推荐作为宫颈细胞学检查的常规辅助手段，积极推行。部分常见HPV高危亚型的预防性疫苗的应用也为预防宫颈癌的发生提供新的思路。
【关键词】 人类乳头瘤病毒；宫颈癌；聚合酶链式反应；液基薄层制片
宫颈癌曾经是美国女性恶性肿瘤中最常见的，而目前宫颈癌的发病率和病死率已经分别降至美国女性恶性肿瘤的第11位和第13位［1］。这种成功主要归功于在过去的50年宫颈巴氏涂片（Pap smear）筛查措施的出现和推广，使早期发现宫颈癌前病变、早期干预治疗成为可能［2］。2005年美国新发宫颈癌共10 800例，但根据50年前发病率计算，若缺少有效的Pap smear筛查，宫颈癌年新发病例约为50 000例，即由于Pap smear筛查的广泛施行，宫颈癌的发病率相比50年前降低了80％［1］。但与此同时，在一些不做常规宫颈筛查的国家，宫颈癌仍排在女性恶性肿瘤的第1位或第2位［3］。这也从另一方面证实了宫颈涂片筛查在早期发现和预防宫颈癌中的重要作用。
虽然宫颈涂片筛查在早期发现、预防宫颈癌中发挥了巨大的作用，但传统筛查方法的敏感性只有50%~60%［4］，即接近一半癌宫颈涂片筛查结果正常者可能被漏诊，而发展为宫颈癌。随着对宫颈涂片筛查的必要性得到了大多数健康人的认可，对传统筛查技术的局限性也受到重视，一些新的检测或筛查技术不断用于临床，其中包括作为宫颈癌必要条件宫颈癌高危人类乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的分子检测和传统宫颈涂片细胞学检查在取材、制片和阅片等方面的改进，均有效地提高了宫颈癌筛查的敏感性和特意性，利于早期发现宫颈癌。
1 宫颈癌与人乳头状瘤病毒
根据最新的ACS［5］和ACOG的宫颈癌防治指
南，肯定了对于有性生活，30岁以上的健康女性，高级别上皮内瘤样病变（CIN 2/3）和宫颈癌患者在初级筛查，治疗和治疗后随访过程中检测高危HPV的必要性。数据显示该检测有很高的敏感性和长期预测值，而且结合宫颈细胞学检查也具有良好的临床相关性。有多项研究显示在CIN3或宫颈癌人群中传统的宫颈细胞学筛查的敏感性比高危HPV检测低25％~40％，而改进为液基薄层制片技术的宫颈细胞学筛查的敏感性也较高危HPV低10%~25％［6］。另超过30岁的受检者如果两项检测均为阴性，则建议筛查间隔可以延长到3年，而期间发生宫颈癌的可能性不显著升高［5］。而如果只进行宫颈细胞学筛查，3年间隔相比1年检查间隔，新发宫颈癌的危险会升高两倍。
高危HPV的持续感染作为宫颈癌的必要因素，已经被广泛接受，其与宫颈癌发生的相关程度远远高于吸烟与肺癌发生的相关性。Munoz等［7］对1 918名病理学证实的宫颈鳞癌和1 928名对照健康女性，使用MY09/11和GP5+/6+两种PCR方法检测宫颈标本中的HPV，并分型。结果表明，GP5+/6+方法得到的宫颈癌和高危HPV暴露的比值比（pooled odds ratio）为158.2（95％ Cl：113.4~220.6）。而且将HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，66，68，70归为高危HPV组，将HPV 6,11,34，42，43，44，74归为可能致癌组［8］。
2 人乳头状瘤病毒的检测
2.1 PCR技术 有报道称：使用实时PCR和RT-PCR等扩增技术检测HPV DNA，虽然设计出能够识别HPV的癌基因E7产物的逆转录PCR，可以检测出与癌症发生关系更为密切的HPV感染，临床意义增强［9］，但敏感度仍不如普通PCR法。使用多重实时PCR对HPV分型，存在技术上的困难，而使用广谱引物混合物由于退火温度不一致和定量分析等方面都难以标准化。所以普通PCR技术还是最实用的模板扩增类的HPV DNA检测方法。HPV亚型众多，临床检测中使用单独的型特异性引物分别扩增显然是不现实的。因此“共同”引物混合物被广泛应用。因L1区为不同亚型HPV之间基因序列最保守的区域，所以大多数共同引物均在此区域内设计。如MY09/11［10］，GP5+/6+［11］和SPF10［12］，总共能够检测大约40种HPV亚型，最高敏感度为10~100个DNA拷贝/PCR反应。而且均在基础和临床前水平上进行了大样本的检测，重复性好。新的研究显示宫颈上皮细胞感染HPV 16后，其中44％的细胞核中存在游离的HPV核酸，44％为整合性感染，其余11％为两种形式的HPV核酸并存［13］。整合后，HPV基因中大部分丢失，包括E1、E2、L1和L2区，针对高危HPV感染后被整合进入宫颈上皮细胞基因组内癌基因E6/E7区域设计共同引物的PCR方法不会因整合后HPV DNA部分片断的消失而产生假阴性。一项比较了使用L1和E6区不同引物的两种PCR方法的研究显示，E6区引物方法不仅可以检测到所有高危亚型的HPV，而且阳性率也高于第一种方法［14］。为了进一步增加HPV检测的敏感性和特异性，巢式PCR技术可以检测到最少1个HPV DNA拷贝，且特异性也大大提高。但是PCR检测方法也有因标本处理，试剂准备和实验室条件等方面限制的原因出现过假阳性的报道［15］。
PCR扩增产物可以通过简单的琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判断，但因HPV亚型众多，在对HPV分型的应用中往往难以完成。HPV共同引物扩增产物通常使用的分型技术有：（1）限制性片段长度多态性分析。使用限制性内切酶消化扩增产物，不同亚型HPV会产生型特异酶切图形，从而达到给HPV感染分型的目的［16］。（2）快速且高通量的测序技术越来越普遍，使HPV根据测序结果分型成为可能，且简便易行，特异性高［17］。但以上两种方法在HPV分型应用中共同的缺陷就是不适于存在HPV混合感染标本的分型检测。而实际上同时存在两种亚型以上HPV混合的现象很常见，如果共同引物扩增出两种以上的扩增产物，其混合物中较少的一种产物则难以被限制性内切酶和直接测序法正确分型或根本检测不到，这就会影响方法的敏感性，造成各亚型感染相对比例的错误估计。（3）利用传统的互补核酸特异杂交原理，可以使用人工合成HPV亚型特异性寡核苷酸探针与PCR扩增产物杂交，来检测和分型［18］。它通过信号放大显色原理，比凝胶电泳具有更高的敏感性，且特异性高，但耗费人力和时间。一项新的逆向杂交分型技术简单易行，有很好的实际应用前景。原理为PCR过程中使用有生物素标记的共同引物，产物在碱性条件下变性后，与含有按一定顺序排列的各亚型HPV特异寡核苷酸探针的薄膜杂交。扩增产物中如果含有一种或几种HPV模板的扩增产物就可以和对应亚型的特异探针紧密结合，而固定在薄膜上，使用与生物素高亲和的链整合素携带的化学发光集团，放大信号，则可在薄膜上特定亚型对应的位置显色，来判断是否存在HPV感染，是哪个亚型，是否存在混合感染［19］。逆向杂交技术是目前敏感性和特异性最适于临床应用的HPV检测、分型技术。
2.2 杂交技术 针对HPV－DNA的分子检测方法除了上述模板扩增类技术（如PCR技术）外，还有信号放大类技术。Digene公司的杂交捕获系统（hybrid capture）是FDA批准临床上使用的第一项辅助宫颈细胞学HPV检测技术［20］。目前商品化HC 2的工作原理是高危和低危两个RNA探针簇中探针序列与特定亚型的HPV基因组中的特异序列互补，可以特异地结合经处理的临床标本中含有的HPV DNA，形成RNA-DNA复合物（高危探针簇包括HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68等总共13个高危亚型的探针；低危探针簇包括HPV-6，11，42，43和44等总共5个高危亚型的探针；附加阳性和阴性对照）。形成的复合物可以被固相特异性抗体捕获，后经过一系列信号放大过程，荧光光度计读取荧光强度。结果>1.0 RLU判定为阳性，半定量分析出被检标本中HPV DNA的拷贝数（1 RLU相当于每毫升标本裂解缓冲液中含有1pg HPV DNA，约5 900个HPV拷贝数）。HC 2检测的敏感度为5 900 DNA copies/ml，只能提示存在或不存在13个高危或5个低危亚型感染，但不能进一步分出具体亚型［15］。而且有报道说HC 2的高危探针簇会和HPV-53，66，67和73等非高危亚型HPV发生交叉反应而产生假阳性［21］。
3 宫颈细胞学筛查
3.1 传统宫颈细胞涂片技术 正如ACS和ACOG宫颈癌指南中强调的，高危HPV的检测只能作为宫颈细胞学诊断的辅助检查，宫颈细胞学发现异常才能提示宫颈病变情况。传统宫颈细胞学筛查近年来得到很多改进，使敏感性大大提升。研究显示，传统宫颈细胞学筛查的敏感性低主要原因来自两方面，66％的漏检是因为取材时细胞丢失和手工涂片质量差，33％是由于细胞学医生自身的主观和客观因素而误诊［22］。
3.2 液基薄层制片技术 自20世纪90年代以来，TCT技术（thinprep cytologic test）为代表的宫颈细胞全自动液基薄层制片技术得到很大发展。其原理是将宫颈脱落细胞先用特制的细胞保存液处理，再通过高精密度过滤膜除去标本中的杂质，再将上皮细胞制成细胞薄层，巴氏染色后由细胞学专家在显微镜下阅片，按TBS法做出诊断报告。另一种液基薄层制片技术LCT（liguid-based cytologic test）的基本方法［23］是通过比重液离心和自然沉淀法去除标本中的黏液、血液和炎性细胞，用余下的上皮细胞制成超薄细胞层，全自动制片过程中同时完成细胞染色，达到更高质量及更高效率。改进的取材和制片技术，将宫颈细胞学筛查的敏感性从50％提高到80％，明显减少漏诊的可能［24］。
以上两项虽在取材和制片技术方面有较大的改进，仍不能改变显微镜下阅片的传统方式，其正确诊断率与阅片人的经验、业务水平及责任心密切相关。3.3 宫颈细胞DNA定量分析技术 近年国内有报道在计算机辅助阅片系统，即宫颈细胞DNA定量分析在宫颈癌的筛查等临床应用方面进行了很多尝试。其根据细胞异倍体表型与肿瘤恶性程度密切相关的原理［25］，对宫颈细胞核进行Feulgen染色后制片，其染色深浅同细胞DNA含量相关。使用DNA－ICM系统自动测定每个宫颈细胞的DNA含量，通过软件可分析出DNA异常增多的异倍体肿瘤细胞［26］，高度敏感地发现癌前病变和浸润癌。2000~2004年使用该项技术对参与宫颈癌普查的约20 000名妇女分别进行人工细胞学检查和DNA倍体定量分析，对异常和疑似异常的1 016例，进一步做阴道镜检查以及宫颈活检。以病理诊断结果为金标准，计算出细胞DNA倍体定量分析方法在筛查GIN3以上宫颈病变的敏感性为82%，特异性为71%；而人工细胞学检查方法则分别为52%和92%［27］。说明液基薄层制片技术结合宫颈细胞DNA倍体定量分析系统，可以显著提高宫颈细胞筛查的敏感性，且利于宫颈癌前病变（CINⅡ/Ⅲ以上）的早期诊断。
4 宫颈癌的预防
2006年，Merck的一种预防性4价HPV疫苗，被FDA批准上市。其主要成分为具有免疫源性的重组HPV L1病毒类似颗粒（VLPs），经过纯化加工制成。在非洲绿猴的体内动物试验中证明，四价疫苗可以诱导HPV亚型特异性中和抗体产生，包括HPV 16，18，6和11共4种亚型。临床试验证明，按疗程接受三支疫苗的成年妇女中99.5％产生了抗HPV免疫应答。试验观察接种后5年，血清抗体滴定度显著高于HPV自然感染对照组［28］。作为性传播疾病的预防性疫苗，其被推荐在少女开始性生活前接受免疫，安全性好，可以有效地防止4种最常见亚型HPV的感染，预防宫颈癌、生殖道疣和内、外生殖器部位的癌前病变。
综上所述，传统宫颈癌筛查的推行，世界范围内宫颈癌的发病率和病死率显著降低，但传统方法的假阴性率可高达40％以上。随着液基薄层制片和计算机辅助阅片分析系统的出现，宫颈细胞学检查技术的敏感性大大提升。高危HPV感染作为宫颈癌的主要诱因，对其的分子检测手段层出不穷，敏感性和特异性极高，应在临床上作为宫颈细胞学检查的辅助手段积极推行。新的预防性四价HPV疫苗的上市，也使真正意义的预防宫颈癌前病变和浸润癌的发生成为可能。
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作者单位：天津，天津医科大学微生物系