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【摘要】 目的 通过体外实验研究Toll样受体3(TLR3)在人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1的表达及聚肌胞PolyI:C对TLR3 mRNA和蛋白的调节作用。方法 体外培养TEV-1细胞;用不同时间及浓度聚肌胞刺激TEV-1细胞后RT-PCR和流式细胞仪检测其TLR3 mRNA和蛋白的表达变化;免疫细胞化学SP染色法检测TLR3蛋白的定位表达。结果 (1)PolyI:C 刺激可上调TEV-1细胞株TLR3 mRNA的表达(P<0.01)，且与刺激时间和剂量呈正相关。(2) PolyI:C 刺激可上调TEV-1细胞株TLR3蛋白表达的平均荧光强度(P<0.01);但荧光阳性细胞数刺激12h与刺激前比较差异无显著性(P>0.05);刺激24h、48h的荧光阳性细胞数与刺激时间和剂量呈正关(24h P<0.05;48h P<0.01)。(3)免疫细胞化学显示TLR3主要定位于TEV-1细胞株的细胞浆。结论 TEV-1细胞株TLR3的mRNA及蛋白的表达与Poly(I:C) 刺激时间及剂量呈正相关;TLR3主要定位于TEV-1细胞株的细胞浆，而细胞核及细胞膜没有观测到明显表达。提示人早孕绒毛外滋养细胞可能通过细胞浆的TLR3参与早孕母-胎界面的免疫反应。
【关键词】 TLR3;Poly(I:C);TEV-1细胞株;流式细胞仪;平均荧光强度;荧光阳性细胞数;免疫细胞化学
Objective To investigate the regulatory effect of PolyI:C on the expression of TLR3 mRNA and protein in the human extravillous trophoblast cell line (TEV-1)，and whether the regulatory effect depends on PolyI:C’s dose and time.Methods Semi-quantitative RT-PCR analysis，flow cytometry and immuo-cytochemistry were used to dedect TLR3 mRNA and protein expression level and location in TEV-I cell line.Results (1)The expression of TLR3 mRNA in TEV-I cell line significantly increased with the PolyI:C’s stimulation time and dose increase; compare to without PolyI:C’s stimulation(P<0.01).The mean fluorescence intensity of the TLR3 protein in TEV-I cell line increased with the PolyI:C’s stimulation time and dose increase; compare to without PolyI:C’s stimulation(P<0.01).(2)The number of fluorescence positive cell of the TLR3 protein stimulated 12 hour had no statistics significance(P>0.05); But its increased with the stimulation time and dose increase in 24 and 48 hour intervention(24h P<0.05 ; 48h P<0.01).(3)The Immuocytochemistry result revealed that TLR3 protein was expressed in TEV-I cell line’s cytoplasma.However，it’s hardly to see the expression in the cellular membrane and nucleus.Conclusion TLR3 protein was expressed in TEV-I cell line and localized to the cytoplasma.The increase of mRNA and protein expression of TLR3 in TEV-I cell line depends on the increase of the dose and time for PolyI:C’s stimulation.
[Key words] TLR3，PolyI:C;TEV-I cell line; flow cytometry; average fluorescence intensity; the number of fluorescence positive cell
正常妊娠时母-胎界面存在着很强的免疫反应，其主要作用是促进胚胎植入和调节胎盘的发育，使母体对半异体来源的胎儿、胎盘产生耐受;同时，维持宿主防御反应，从而阻止病原微生物对机体组织和妊娠的破坏。母胎界面处的滋养细胞、免疫活性细胞及细胞因子，构成了母-胎界面的免疫微环境，对于妊娠的建立、维持、胎儿的生长发育以及分娩发动起着重要作用[1]。而妊娠病理(如:反复自发性流产、早产、子痫、胎膜早破、IUGR等)则与母-胎界面的免疫微环境的改变有关[2]。因此，母-胎界面处细胞生物学和分子免疫学的研究已成为医学研究的热点之一。
天然免疫性细胞是可以通过对病原体表达的病原体相关分子模式识别各种病原体的。Toll样受体是近年来发现的重要的免疫受体，它在天然免疫中通过对病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的识别发挥作用，通过刺激信号的级联反应导致细胞因子的产生和协同刺激因子的表达，从而在天然免疫和获得性免疫中起到了桥梁的作用[3]。近年来的研究进展还发现Toll样受体也广泛表达于女性生殖系统及母-胎界面，在局部抗感染、生殖免疫、妊娠免疫的生理及病理过程中发挥着重要作用[4，5]。本研究采用RT-PCR、流式细胞仪检测及免疫细胞化学SP法染色法测定Toll样受体3(TLR3)蛋白在人早孕绒毛膜外滋养细胞株(TEV-1)的定位及基因、蛋白表达和聚肌胞对其表达的影响，从而探讨TLR3在母-胎界面的表达及免疫作用。
1 材料与方法
1.1 细胞株来源 人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1由香港大学馈赠。
1.2 试剂
单克隆小鼠抗人TLR3一抗：美国Santa Cruz 生物技术公司;羊抗小鼠IgG荧光二抗(FITC标记)：购自美国KPL生物技术公司;引物：由上海博亚公司合成;Poly(I:C)：美国Sigma生物技术公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
TEV-1细胞株接种于细胞培养瓶，用DMEM/F12培养液及10%胎牛血清的混合液4～5ml在培养箱中培养。待80%融合后，吸掉旧培养基，D-Hanks液洗涤细胞1次，0.25%胰蛋白酶消化1～2min，在倒置显微镜下观察，当细胞将分离而呈圆粒状时，立即加入适量含血清的新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。再用吸管反复吹打细胞培养瓶壁使细胞脱落，并把细胞吹散至均匀。然后依1：3的比例转移至新的培养瓶中，以上述条件培养。
1.3.2 流式细胞仪检测TLR3蛋白在TEV-1细胞株的表达
将TEV-1细胞株种植于7个培养皿中培养，生长至80%融合后换成1ml的optin -MEM培养液培养。6个培养皿中分别加入poly(I:C)12μg、25μg及分别培养12、24、48h，另一培养皿则不加。然后制成细胞悬液，无水乙醇固定，加入50μl 0.2% TritonX100破膜，PBS洗2次。加BSA稀释的单克隆小鼠抗人TLR3一抗100μl，4℃过夜，PBS洗2次。加BSA稀释的羊抗小鼠IgG荧光二抗(FITC标记)100μl，4℃孵育30min，PBS洗2次,标本置流式细胞仪上检测。
1.3.3 RT-PCR
1.3.3.1 RNA的提取
参照TRIZOL试剂盒(美国GIBCOBRL公司)说明书进行提取RNA。
1.3.3.2 逆转录cDNA合成
将RNA稀释为1μg/μl，取2μl RNA加入1μl Oligo (dT)15 (0.5μg/μl)、DEPC-H2O 7μl，充分混匀后，离心，在70℃孵育5min，迅速置于冰上，3min后离心;加入5×Reaction Buffer 4μl，dNTP Mix(10mmol/L)1μl，M-MLV Reverse Transcriptase(Promega公司，200U/μl)1μl，DEPC-H2O 4μl;42℃孵育60min;95℃孵育10min灭活逆转录酶活性，然后置4℃以备作PCR用。
1.3.3.3 引物设计 见表1。表1 β-actin和TLR3引物序列
1.3.3.4 聚合酶链式反应(PCR) 扩增体系：10×Taq Buffer 5μl，MgCl2(25mmol/L) 3μl，dNTP Mix(10mmol/L)1μl，引物各(10μmol/L)1μl，cDNA 2μl，Taq 聚合酶(1U/μl)1μl，DEPC-H2O 36μl ;95℃预变性5min，94℃变性45s，54.4℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃终末延伸10min。
1.3.3.5 琼脂糖凝胶电泳 75V电压下2%琼脂糖凝胶电泳40min，紫外灯下观察条带。
1.3.3.6 采用英国UVP公司GDS-8000型全自动凝胶成像分析仪扫描DNA条带灰度值，用软件分析条带灰度比值。
1.3.4 免疫细胞化学SP法染色 将盖玻片置于细胞培养皿，将TEV-1细胞株接种于其中，放入细胞培养箱培养进行细胞爬片;取出细胞爬片冰丙酮固定20min，细胞面向上固定于载玻片上;3%H2O2 封闭内源性酶;5%的正常山羊血清封闭;以 1：100浓度稀释的单克隆鼠抗人TLR3一抗湿盒内4℃孵育过夜;苏木素复染后脱水、透明、中性树胶封片。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统拍照。
1.3.5 统计学处理 所有数据均以均数±标准差(x±s) 表示,用SPSS 11.5统计软件进行数据分析,组间比较采用LSD 检验。
2 结果
2.1 TLR3 mRNA的表达及变化 TLR3 mRNA的表达随刺激时间及剂量的梯度的上升而增加，与刺激前比较，P<0.01(见图1、表2)。1泳道为刺激前结果;2泳道为12μg、12h结果;3泳道为25μg、12h结果;4泳道为12μg、24h结果;5泳道为25μg、24h结果;6泳道为12μg、48h结果; 7泳道为25μg、48h结果;M为Marker;530bp为β-actin扩增片段;334bp为TLR3扩增片段图1 TLR3的RT-PCR扩增产物检测结果表2 不同剂量及时间梯度Poly(I:C)刺激TLR3 mRNA在TEV-1细胞株的表达
2.2 TLR3蛋白的表达及变化 流式细胞仪检测TLR3蛋白的表达，平均荧光强度随刺激时间及剂量的增加而上升，与刺激前比较P< 0.01(见表3); 而荧光阳性细胞数刺激12h与刺激前比较差异无显著性(P>0.05);刺激24h、48h随刺激时间及剂量的增加而上升，P<0.05或<0.01(见表4)。表3 平均荧光强度 表4 荧光阳性细胞数
2.3 TLR3蛋白在免疫细胞化学的定位 免疫细胞化学(SP染色法)显示TLR3定位于TEV-1细胞株的细胞浆(如图2)。图2 TEV-1细胞株的细胞浆中可见到清晰的棕黄色颗粒，而细胞核及细胞膜则很难看见
3 讨论
近年来Toll样受体在母-胎界面的表达及免疫功能研究备受关注。研究表明，TLR1-10的mRNA及蛋白在滋养细胞和晚孕胎盘中都有表达，同时其相关分子和共受体CD14、MD2、MyD88也有表达。Toll样受体通过识别配体，从而产生效应，其中TLR3识别的配体是病毒双链RNA。目前有关TLR3在妊娠中的研究有：(1)国内外许多试验研究发现，腹腔注射大剂量PolyI:C的小鼠流产率和胚胎吸收率增加，滋养细胞的TLR3被配体PolyI:C激活后，细胞内IL-2增加，IL-10减少;而且巨噬细胞、NK细胞毒性增加。普遍认为，IL-10是维持妊娠的重要因子，而IL-2是已知的致流产剂。(2)Masuhiro和Shinsaku[6]检测了10种人类TLR和21种TLR相关基因分布情况，发现绒毛及胎盘组织中，TLR3水平居于最高(以早孕滋养细胞最突出)，该研究采用组织提取RNA方法，对胎盘TLR3细胞定位未能提供进一步研究。
本试验进行了Toll样受体其中之一TLR3在母-胎界面的重要细胞人早孕绒毛膜外滋养细胞株的表达及影响的研究。检测了人早孕绒毛膜外滋养细胞株TLR3 mRNA及蛋白的表达，并且通过免疫细胞化学显示了TLR3蛋白定位(细胞浆);还检测了Poly(I:C) (聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸;简称聚肌胞，是一种人工合成的双链RNA)刺激后TLR3 mRNA及蛋白的表达的调节作用。TLR3 mRNA的表达随刺激时间及剂量的梯度的上升而增加，与刺激前比较差异有显著性。流式细胞仪检测TLR3蛋白的表达，平均荧光强度随刺激时间及剂量的梯度的上升而增加，与刺激前比较差异有显著性;而荧光阳性细胞数刺激12h与刺激前比较差异无显著性;刺激24h、48h随刺激时间及剂量梯度的上升而增加，差异有显著性。说明了TEV-1 细胞株TLR3的mRNA及蛋白的表达与Poly(I:C)刺激时间及剂量呈正相关。但是荧光阳性细胞数刺激12h与刺激前比较差异无显著性，说明不同水平检测TLR3表达的灵敏度不同，或者可能是蛋白的表达滞后于mRNA的表达造成的。
母-胎界面的Toll样受体被激活后，通过MyD88依赖或非依赖途径及核转录因子κB、JNK 等多条信号途径活化细胞，从而产生多种细胞因子及炎性趋化因子[7]：如IL-6、IL-8、GRO-a、MCP-1、MCP-1a、RANTES，这些细胞因子与白细胞的游走及机体防御有关。其中的趋化因子不仅便利了免疫细胞在蜕膜中的募集来保护机体和正常妊娠(例如:蜕膜中的巨噬细胞、中性粒细胞可以吞噬凋亡的滋养细胞)，而且被认为为正常的妊娠提供了免疫方面的支持。在胚胎种植期，胚胎附着、粘连所必需的整合素和粘连蛋白可能依赖于Toll样受体激活后产生的前炎症因子的分泌[8]。Toll样受体被激活后，可以直接激活凋亡级联反应酶caspase或产生TNF-α和IFN-γ等细胞因子诱发细胞的凋亡。绒毛滋养细胞的凋亡是正常妊娠的生理现象，大量形态学研究发现正常妊娠期伴随着绒毛滋养细胞的凋亡与分化，说明其凋亡与胎盘的形成、重塑相关。凋亡不仅可以去除衰老的合体滋养细胞，还能促进细胞滋养细胞融合而形成合体滋养细胞。Toll样受体不但参与妊娠的生理过程，也与妊娠病理相关。很多研究发现，妊娠相关疾病，如早产、子痫、IUGR、胎膜早破、反复自发性流产都与感染及Toll样受体诱导的滋养细胞的过度凋亡密切相关。已经观察到，患羊膜炎及早产妇女的滋养细胞TLR-2或(和)TLR-3表达增高，而子痫前期患者的滋养细胞TLR-4表达增高。在妊娠相关疾病病例中，蜕膜组织中的巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞显著增高，而且其分布也发生改变[9]。这些改变了的免疫细胞的反应可能严重地破坏了正常的妊娠。TLRs可能作为“危险信号”与妊娠相关疾病的桥梁，诱发免疫反应，导致滋养细胞过度凋亡[10]。
随着对母-胎界面TLRs家族研究的不断深入，TLRs在妊娠期免疫应答中的作用及具体的作用机制将进一步被揭示。而且有望针对阻断TLRs信号通路，如核转录因子κB通路，而治疗妊娠相关疾病。
【参考文献】
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