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【摘要】 目的 比较叶酸与四氢生物蝶呤对高胆固醇血症兔尿蝶呤的影响。方法 24只新西兰大白兔随机分成4组，分别予以正常饮食（A组）、高胆固醇饮食（B组）、四氢生物蝶呤+高胆固醇饮食（C组）、叶酸+高胆固醇饮食（D组）。适应性喂养1周后，进入实验阶段，60d后取血清测总胆固醇，同时留尿样进行尿蝶呤分析。结果 A组血清总胆固醇含量明显高于其他各组（P<0.01），动物模型建立成功;与其它各组比较，B组尿新蝶呤升高而生物蝶呤下降，差异有统计学意义（P<0.05）。四氢生物蝶呤组与叶酸组间无统计学差异。结论 高胆固醇血症导致四氢生物蝶呤缺乏，外源性补充四氢生物蝶呤或叶酸均未可明显增加高胆固醇血症兔细胞内四氢生物蝶呤的含量。
关键词 四氢生物蝶呤 叶酸 总胆固醇 新蝶呤 生物蝶呤
Effect of tetrahydrobiopterin and folic acid on urinary pterin in hypercholesterol rabbits
Lu Wei，Zhang Hua，Gao Lijian，et al.
Qingdao No.1Sanatorium of Jinan Military Area of PLA，Qingdao266071
【Abstract】 Objective To compare the effects of tetrahydrobiopter in and folic acid on uropterin in hypercholesˉterol rabbits.Methods 24rabbits were randomly divided into4groups:normal diet（group A），hypercholesterol diet（group B），tetrahydrobiopterin plus hypercholesterol diet（group C），folic acid plus hypercholesterol diet（group D）.Total cholesterol（TC）and uropterin were determined after60days.Results The amount of total cholesterol in group A was the highest among these groups（P<0.01）.It proved that the model of hypercholesterol rabbits were established successfully.Compared with other groups，the concentration of neopterin in group B was the highest（P<0.05）.On the contrary，biopterin was the lowest（P<0.05）.There was no significant difference between group C and group D.Conˉclusion It suggests that hypercholesterol can induce the lack of tetrahydrobioterin.Both tetrahydrobiopterin and folic acid can not explicitly increase cellular tetrahydrobioterin in hypercholesterol rabbits.
Key words tetrahydrobiopterin folic acid total cholesterol neopterin biopterin
许多心血管疾病都与一氧化氮（Nitric Oxide，NO）活性低下或生成不足有关，如动脉粥样硬化、高血压病、心肌缺血再灌注、心力衰竭等。已有动物研究表明 ［1，2］ ，四氢生物蝶呤作为一氧化氮合酶的重要辅助因子，参与NO的合成。外源性补充可减少各种氧自由基的产生，降低脂质过氧化的水平，从而延缓并减少心脑血管疾病的发生及进展。但BH 4 的价格昂贵，使其临床应用受到限制。研究已明确叶酸与四氢生物生物蝶呤系类似物 ［3］ ，本研究旨在观察FH 4 是否可以提高实验性高胆固醇血症兔组织内的BH 4 含量，以探讨FH4的作用机制及价廉的BH 4 取代FH 4 的可行性。本实验采用常用的尿液蝶呤分析来检测BH 4 含量。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选取纯种新西兰大白兔（青岛市动物实验中心提供，体质量2.0～2.25kg，雄雌不限）24只，随机分成4组（n=6）。在适应性喂养1周后，进入实验阶段。A组进食普通饲料，其余各组进食高脂饲料。B组为模型组，C组为BH 4 干预组，D组为叶酸干预组。高脂饲料的配方为:1%胆固醇，8%猪油，75%蛋黄粉，83.5%普通颗粒饲料。限食量，每兔每日250g，分笼喂养，共喂养60d。每半月测体重一次。C组同时给予BH 4 2mg/（kg·d），溶解在食用水中，与水同饮;D组同时给予叶酸2mg/（kg·d），溶解在食用水中，与水同饮。
1.2 标本采集及处理 所有实验动物喂养60d后，取耳缘静脉血2ml，室温下放置15min，4000r/min离心15min，取血清，分装编号。测定血清总胆固醇（TC）含量。同时，抽取膀胱尿液5ml，马上加入维生素C（20mg/ml urine），避光下混合均匀后分装于避光容器中，冷冻在-80℃待分析。
1.3 统计学方法 实验数据经SPSS11.0统计软件处理，P<0.05差异有统计学意义;P<0.01差异有显著统计学意义。
2 结果
2.1 各组血清TC含量测定结果 见表1。
表1 各组血清TC含量 （略）
注:与A组比较， △ P<0.01
表1说明，与正常饮食组相比较，其它各组的胆固醇明显升高，差异有非常显著性（P<0.01），BH 4 组与FH 4 组的胆固醇虽低于模型组，但差异无显著性。高胆固醇血症兔的模型已建立成功。
2.2 各组尿样中生物蝶呤测定结果 见表2。
表2 各组样品中尿蝶呤含量 （略）
注:与B组比较， △ P<0.05
表2说明，模型组与其它各组比较，新蝶呤升高而生物蝶呤下降，差异有显著性，P<0.05。
3 讨论
近年来，一氧化氮（Nitric Oxide，NO）及一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）的关系及其生理功能受到了人们的广泛关注。由NOS合成的NO具有多种生理和病理作用，可使血管平滑肌舒张，抑制白细胞粘附于内皮细胞上，抑制血小板与血管壁间的相互作用，以及抑制血管平滑肌细胞的增生和损伤。
实验表明 ［4］ 细胞内BH 4 水平决定了结构型一氧化 氮合酶（constitutive NOS，cNOS）是产生NO或超氧化物，并调节着二者的平衡。此外，BH 4 还可降低次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产生超氧化物的能力，具有直接的抗氧化作用，减少组织、细胞的氧化损伤。因此，BH 4 在维持正常血管反应过程中具有重要的生理学意义。
高脂造成BH 4 含量绝对或相对减低可能的原因是:（1）脂质过氧化物及氧自由基生成增多造成细胞内氧化应激状态 ［5］ ，而BH 4 在细胞内的合成有赖于正常的氧化还原环境;（2）NOS活性上调，导致BH 4 活性相对降低。
叶酸与BH 4 为类似物，两者结构相似，参与的递氢、递甲基反应相似，催化的酶亦相同 ［3］ 。Hyndˉman ME ［6］ 等证实叶酸与BH 4 的作用靶位相似，它可直接作用于NOS提升NO的产量和促进内皮功能。另外，叶酸尚可提高BH 4 的生物利用度，刺激内源性BH 4 的再生 ［7］ 。叶酸在细胞内很易被还原为甲基四氢叶酸，后者是前者在循环系统的主要活性形式，甲基四氢叶酸是同型半胱氨酸（Hcy）降解途径中重新合成蛋氨酸的甲基供体，由此可降低Hcy的浓度。叶酸缺乏导致代谢通路受阻，血中Hcy累积，成为高Hcy血症。研究发现，Hcy可在金属离子介导下，自身氧化生成过氧化物及氧自由基，损伤内皮细胞的结构和功能，降低了内皮依赖性舒张因子-NO的生物活性 ［8，9］ ，并提高了血液凝固性，从而启动了粥样硬化斑块形成。有报道 ［6］证明足量的叶酸可优化NOS的活力、防止硝酸酯类药物的耐受。从而保护血管内皮，延缓心脑血管疾病的进展。
BH 4 缺乏症最常见是由于BH 4 合成代谢途径中的合成酶6-丙酮酰四氢蝶呤（PTPS）缺乏所致 ［10］ ，也可因二氢生物蝶呤还原酶（DHPR）活性降低所致，DHPR活性降低的病人体内往往积聚大量的FH 2 ，Smith I等 ［11］ 报道用大剂量的叶酸可促进FH 2 向FH 4 转化，从而提高细胞内的FH 4 水平。当因PTPS缺乏导致下降时，尿新蝶呤（neopterin，N）明显增加，生物蝶呤（biopterin，B）明显降低，N/B增高。尿蝶呤分析是评定BH 4 的有效的诊断方法，随着蝶呤检测技术的发展，目前，国外越来越倾向直接检测血浆中生物蝶呤、尿蝶呤及BH 4 的浓度，该检测对设备及技术要求较高 ［12］ 。本实验的统计数字表明:高脂饮食导致生物蝶呤明显降低，而新蝶呤则明显升高，与正常饮食组相比较，有显著的统计学差异。但在叶酸及BH 4 的干预下，生物蝶呤及新蝶呤均可恢复，两组间无统计学差异。说明叶酸与BH 4 相似，均可提高细胞的BH 4 含量。
目前，叶酸改善内皮功能的机制目前倾向于以下几种观点 ［11，13］ :（1）增加BH 4 从醌型BH 2 再生，对于BH 2 积聚的患者，用叶酸的代谢进行干预，可提高BH 4 的水平;（2）可能作为NO合成的电子供体或蝶呤还原酶;（3）减少同型半胱氨酸的产生;（4）加强BH 4 与eNOS结合;（5）提高BH 4 的生物利用度;（6）直接的抗自由基作用。本实验表明，FH 4 与BH 4 均无明显降低血清总胆固醇的作用，说明FH 4 与BH 4 对内皮细胞的保护作用并不依赖于降低血脂。叶酸干预组同BH 4 干预组相似，均可明显升高尿蝶呤，与模型组比较有统计学差异（P<0.05）。该实验结果支持上述观点，提示外源性补充叶酸可提高高胆固醇血症兔组织内BH 4 的水平，从而保护血管内皮功能减少心血管事件的发生。为心血管疾病的防治寻求新的适合我国国情的治疗途径。国外对此研究已在临床开展，而国内的研究尚需加强。
参考文献
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（收稿日期:2004-11-18）
（编辑江 风）
作者单位:266071青岛济南军区青岛第一疗养院
266071海军青岛401医院干部病房二科
266003青岛大学医学院研究生部
266003青岛大学医学院心血管内科