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【摘要】 目的 探讨中药对肺间质纤维化的预防和治疗作用。方法 Wistar大鼠160只，随机分为8组：（1）对照组［（1）组］：灌胃生理盐水（NaCl）2.25mg/(kg·d)；（2）强的松组［（2）组］：灌胃强的松6mg/(kg·d)；（3）预防Ⅰ组［（3）、（4）组］：灌胃抗肺纤Ⅰ号7.5g/(kg·d)、15g/（kg·d)；（4）预防Ⅱ组［（5）、（6）组］：灌胃抗肺纤Ⅱ号7.5g/(kg·d)、15g/(kg·d)；（5）治疗组［(7)、(8)组］，分别灌胃抗肺纤Ⅰ和Ⅱ号15g/(kg·d)。（1）～（6）各组于气管内滴入博莱霉素（BLMA5） 5mg/kg，次日开始给药。（7）、（8）组于气管内滴注BLMA5，5mg/kg，15天后开始给药。各组动物分别于给药14天、28天随机处死10只，然后检测各项观察指标。结果 观察28天后，对照组：动物体重增加71%（P＜0.05），肺胶原蛋白含量提高17.7%（P＜0.05），过氧化脂质含量提高1.86倍（P＜0.05），羟脯氨酸含量提高24.01%（P＜0.05）。强的松组：动物体重减轻80%（P＜0.01），肺胶原蛋白降低35.3%（P＜0.01），羟脯氨酸含量降低44.2%（P＜0.01）。预防组：动物体重分别增长55.8%（P＜0.05）和47.0%（P＜0.05），肺胶原蛋白含量降低36.2%（P＜0.05）和26.5%（P＜0.05），羟脯氨酸含量降低24.9%（P＜0.05）和70.7%（P＜0.05）。治疗组肺胶原蛋白降低13.0%（P＜0.01）和31.0%（P＜0.05），羟脯氨酸含量降低30.0%（P＜0.05）和21.0%（P＜0.05）。结论 抗肺纤Ⅰ和Ⅱ号均具有预防和治疗肺间质纤维化的作用。
【关键词】 肺间质纤维化；中药；预防和治疗；皮质类固醇
The inhibitory effect of antipulmonary fibrosis agents Ⅰ and Ⅱ on the rat model of blemycin-induced pulmonary fibrosis
ZHANG Qi-kun,XIAO Ji-yuan.
The Second Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730030，China
【Abstract】 Objective To study the effect of antipulmonary fibrosis agent Ⅰ and Ⅱ on the rat model of blemycin-induced pulmonary fibrosis.Methods Wistar rats induced by intratracheal instillation of blemycin were randomly divided into six groups with twenty each group.Then bronchus was recepted daily saline 2.25mg/kg(group A),prednisone 6mg/kg(group B),APFAⅠ 15g/kg(group C) and APFAⅠ 15g/kg(group D) from the next day respectively.The rats in group E and F received daily APFAⅠ 15g/kg and APFAⅠ 15g/kg respectively from the 15th day.Ten rats in each group were randomly sacrificed 14 and 28 days after intratracheal instillation.Then the rats weight collagen,hydroxyproline of the lung tissue were detected.Results Collagen of rat lung tissue in group B,C,D,E and F decreased 35.3%,36.2%,25.6%,13.0% and 31.0% (five of P＜0.05,respectively),meanwhile hydroxyproline decreased 44.2%,24.9%,70.2%,30.0% and 21.0% (five of P＜0.05）,respectivety.Conclnsion The anti-pulmonary fibrosis agents Ⅰ and Ⅱ can prevent and treat blemycin-induced pulmonary fibrosis in rats.
【Key words】 pulmonary fibrosis;herbal medicine;prevention and treating;corticoid
弥漫性肺间质纤维化（interstitial lung disease,ILD)的治疗是一个很棘手的问题，目前常规治疗仍首选肾上腺皮质激素。但激素治疗仅对肺泡炎阶段有一定疗效，而且不能完全控制病情的发展，多因长程使用会产生不可耐受的副作用而终止治疗。本研究的目的，旨在常规治疗的基础上，采用中药抗纤Ⅰ号、Ⅱ号对肺间质纤维化模型大鼠肺组织羟脯氨酸、胶原蛋白含量以及动物体重、存活率、肺组织病理学影响的实验研究，为临床预防和治疗ILD提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验试剂 对二甲基氨基苯甲醛（天津化学试剂研究所，批号980421）、牛血清白蛋白（中国科学院生物物理所中生公司，批号980912）、L-羟脯氨酸（中国科学院生物物理所中生公司，批号900728）、强的松（浙江医药股份有限公司，批号990608）、博莱霉素（BLMA5，天津河北制药厂，批号9901201）、抗肺纤Ⅰ号（粉剂，自拟，由莪术、川芎、全瓜蒌、车前子、白僵蚕、牛蒡子、石膏、甘草等8味中药组成，兰州大学第二医院制剂部提供）、抗肺纤Ⅱ号（粉剂，自拟，由黄芪、莪术、川芎、全瓜蒌、车前子、白僵蚕、大黄等8味中药组成，兰州大学第二医院制剂部提供）。
1.1.2 实验仪器 日本岛津UV-120—02型分光光度计，MettlerAE-260电子天平（瑞士梅物勒公司），LD4-2A医用离心机，OLYMPUS-B07照相显微镜。
1.1.3 实验动物分组及给药剂量［1］ 清洁级Wistar大鼠160只，雌雄各半，体重（180±5）g，由甘肃省医学科学研究院实验动物研究室提供。随机分为8组，每组20只。（1）对照组：灌胃生理盐水（NaCl)2.25mg/(kg·d)；（2）强的松组：灌胃强的松6mg/(kg·d)；（3）抗肺纤Ⅰ号小剂量组：灌胃抗肺纤Ⅰ号中药7.5g/(kg·d)；（4）抗肺纤Ⅰ号大剂量组：灌胃抗肺纤Ⅰ号中药15g/(kg·d)；（5）抗肺纤号Ⅱ号小剂量组：灌胃抗肺纤Ⅱ号中药7.5g/(kg·d)；（6）抗肺纤Ⅱ号大剂量组：灌胃抗肺纤Ⅱ号中药15g/(kg·d)；（7）抗肺纤Ⅰ号治疗组：灌胃抗肺纤Ⅰ号中药15g/(kg·d)；（8）抗肺纤Ⅱ号治疗组：灌胃抗肺纤Ⅱ号中药15g/(kg·d)。（1）～（6）各组于气管内灌注BLMA5（5mg/kg)，次日开始给药。（7）、（8）组于气管内灌注BLMA5（5mg/kg)后15日开始给药。各组动物在给药第14天、28天分别随机处死10只。全部实验动物在兰州军区总医院实验动物科清洁级动物实验室完成。
1.2 方法
1.2.1 IPF 动物模型的制备乙醚全身麻醉动物后仰卧固定于大鼠实验台上，将舌拉出，用压舌板压迫舌腹，在额镜直视下趁动物吸气瞬间迅速将连有1ml注射器的平端9号针刺入气管约4～5cm，缓慢注入药物，随后将动物直立旋转，尽量使药液在肺内分布均匀。
1.2.2 取材 动物在给药第14天、28天，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸切取左肺，冰冻待生化测定，自气管内向右肺注射2%多聚甲醛-1.25%戊二醛磷酸缓冲液（pH=7.4)后，浸入上述固定液固定48h，石蜡包埋切片，HE染色。
1.2.3 肺过氧化脂质（LPO）测定 按MDA-TBA比色法，用日本岛津UV-120-02型分光光度计532nm处比色测定。
1.2.4 肺组织胶原蛋白含量测定 按Lowyr法［2］，以0.0326、0.0978、0.1632、0.2282、0.2938mg标准牛血清白蛋白及其A值绘制标准曲线。用回归法公式计算肺组织胶原蛋白含量(x)，回归法公式：Y=a+bx(a=0.0182,b=2.6103,r=0.9999,Y：肺组织光密度）。
1.2.5 肺组织羟脯氨酸测定 羟脯氨酸多以寡肽形式存在，测定羟脯酸含量时，先将肺组织用6ml/L的HCl水解成游离羟脯氨酸，再用氯氨T将羟脯氨酸氧化，在加热条件下，羟脯氨酸的氧化产物δ-吡洛啉-4羟基-2羟酸和吡咯-2羟酸与对二甲基氨基苯甲醛作用呈红色，用日本岛津UV-120-02型分光光度计560nm处比色。以0.0124、0.0248、0.0372、0.0496、0.062mg标准羟脯氨酸及其A值绘制标准曲线，用回归法公式Y=a+bx(a=0.1201,b=9.3790,r=0.9985,Y：肺组织光密度），计算肺组织羟脯氨酸含量（x）。
1.2.6 组织病理学检查 在光学显微镜下观察，根据Szapiel等［3］方法确定。肺泡肺炎和纤维化的程度各分为4级：无肺泡肺炎（-）；轻度无肺泡肺炎（+）；中度无肺泡肺炎（++）；重度无肺泡肺炎（+++）。肺间质纤维化分级标准：无纤维化（-）；轻度纤维化（+）；中度纤维化（++）；重度纤维化（+++）。
1.3 统计学方法 所有数据用（x±s）表示，组间比较采用t检验。肺泡炎及肺纤维化程度以等级资料统计。率的比较采用χ2检测，P＜0.05为具有统计学意义。
2 结果
实验结果见表1～7。
表1 抗肺纤Ⅰ和Ⅱ号中药对大鼠体重的影响 （略）
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
气管灌注博莱霉素后，其他各组给药动物体重增长率显著低于对照组，其中强的松组较给药前体重减轻了80%,见表1。
气管灌注博莱霉素第28天，强的松组动物生存率显著低于对照组（P＜0.01），停药后7天比较，强的松组动物生存率为0，其他各组再未见死亡，见表2。
气管灌注博莱霉素至少第28天，给药组动物肺组织胶原蛋白含量显著低于对照组（P＜0.01），组内不同时间比较，给药28天动物肺组织胶原蛋白含量显著低于14天（P＜0.01），其中抗肺纤Ⅰ号中药更为明显，见表3。
表2 抗肺纤Ⅰ和Ⅱ号中药对IPF大鼠生存率的影响 （略）
注：与对照组比较，*P＜0.01
表3 抗肺纤Ⅰ和Ⅱ号中药对IPF大鼠肺组织胶原蛋白含量的影响（略）
注：与对照组比较，*P＜0.01；组内不同时间比较，▲P＜0.01
表4 抗纤Ⅰ和Ⅱ号中药对IPF大鼠肺组织过氧化脂质含量的影响（略）
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表4看出，气管灌注博莱霉素第14天，给药组动物肺组织过氧化脂质含量明显低于对照组（P＜0.05），其中抗肺纤Ⅱ治疗组更为显著（P＜0.01）。给药28天，动物肺组织胶原蛋白含量降低，动物肺组织过氧化脂质含量升高。
表5 抗纤Ⅰ和Ⅱ号中药对IPF大鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响（略）
注：与对照组比较，*P＜0.05；组内不同时间比较，▲P＜0.01
由表5看出，气管灌注博莱霉素第28天，给药组动物肺组织羟脯氨酸含量显著低于对照组（P＜0.01）。其中抗肺纤Ⅱ号中药尤为显著。
表6 给药第14天各组动物肺组织病理学分级情况（略）
表7 给药第28天各组动物肺组织病理学分级情况 （略）
以上实验结果：（1）在对照组，气管灌注博莱霉素第28天测定，动物体重增长了71%，肺组织胶原蛋白含量比第14天提高了17.70%，过氧化脂质含量提高了1.86倍，羟脯氨酸含量提高了24.01%。肺组织病理学检察，炎性细胞数、纤维化程度明显增加，IPF大鼠模型建成。（2）在预防组，气管灌注博莱霉素，给药第28天测定，强的松组动物体重减轻了80%，肺组织胶原蛋白降低了35.3%，羟脯氨酸含量降低了44.2%。抗纤Ⅰ和Ⅱ号中药组体重分别增长了55.8%和47.0%，肺组织胶原蛋白分别降低了36.2%和25.6%，羟脯氨酸含量分别降低了24.9%和70.2%。肺组织病理学检查，炎性细胞、纤维化程度明显降低。说明强的松和抗纤Ⅰ和Ⅱ号中药具有抑制肺纤维化的作用。但是，强的松抑制内分泌系统和免疫系统功能。因毒副作用大而导致实验动物死亡数增加［3］。（3）在治疗组，气管灌注博莱霉素后15天给药，给药28天测定，肺组织胶原蛋白分别降低了13.0%和31.0%，羟脯氨酸含量降低30.4%～21.0%。说明抗纤Ⅰ和Ⅱ号中药治疗IPF，不但具有抑制肺纤维化的作用，而且能逆转肺纤维化，具有较好的预防和治疗作用。
3 讨论
通过上述动物实验结果，我们认为：（1）采用糖皮质激素（强的松）和免疫抑制剂治疗IPF，可抑制炎症和模型动物肺组织羟脯氨酸、胶原蛋白的合成，起到治疗肺纤维化的作用［3］。但是，糖皮质激素（强的松）和免疫抑制剂可使内分泌系统、免疫系统受到抑制，因免疫功能低下而导致死亡［4］。（2）采用中药抗肺纤Ⅰ和Ⅱ号治疗IPF，不但可抑制炎症和模型动物肺组织羟脯氨酸、胶原蛋白的合成，起到预防肺纤维化作用，而且避免了常规治疗的不足和治疗中出现的毒副作用［5～7］。（3）采用中药抗肺纤Ⅰ和Ⅱ号治疗IPF，可使已形成的胶原纤维组织降解，起到治疗肺纤维化的作用。（4）采用中药抗肺纤Ⅰ号治疗IPF毒副作用小，安全可靠，价格便宜，服用方便，值得推广使用。
【参考文献】
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4 Coke Rk,Laurent GJ.Pulmonary fibrosis:cytokins in balance.Eur Respir,1998,11:1218.
5 金鸿斌，何春娥.中药治疗肺间质纤维化.河南中医，2001，21（2）：50-51.
6 王小平，李晓光，甘丽虹，等.中医治疗特发性肺纤维化22例.北京中医药大学学报，2001，24（1）：77.
7 唐玲华，李春生.特发性弥漫性肺间质纤维化13例治疗报告.中医杂志，1997，38（1）：35-36.
（编辑：明 石）
*基金项目：甘肃省中青年科研基金资助项目（编辑：ZR-97-089）
作者单位： 730030 甘肃兰州，兰州大学第二医院呼吸科（△药剂科）