蛋白指纹图谱技术与肝病研究

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   ［摘要］  SELDITOFMS是近些年来出现的一种自动快捷、灵敏特异、高通量的蛋白组学研究技术，在临床诊断和基础研究中都有良好的应用前景。本文结合国内外近年来文献报道对该技术在肝病研究中进展概况加以评述。

    ［关键词］  蛋白指纹图谱；SELDITOFMS；肝癌；标志物

       肝脏是人体最大的腺体，是人体内最重要的器官之一，其基本功能是物质代谢，还包括分泌、排泄、物质转化及胆红素代谢等功能。肝脏疾病严重影响人类健康，并对社会经济产生巨大影响。肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，严重危害人们的身体健康。早期诊断和及时治疗是提高肝癌患者成活率的关键，但目前的诊断方法敏感度低、特异性差，已成为肝癌诊疗的一个难题，所以寻找特异的肝癌标志物已经成为肝病研究领域的热点。蛋白质组学(proteomics)技术是后基因组时代又一重要研究工具，在生命科学领域中发挥重要作用［1～3］。蛋白质组学是通过对不同时间和空间发挥特定功能的蛋白质群体进行研究，阐明生物体全部蛋白质的表达和功能模式，包括鉴定蛋白质表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能及相互作用方式等，从机体或细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律。

    随着蛋白质组学技术的发展，该技术日益应用于肝病研究中［4～6］。人类蛋白质组学组织(human proteome organization,HUPO)已经发起了人类肝脏蛋白质组研究计划(human liver proteome project,HLPP)，旨在通过对肝脏蛋白质组进行系统研究，从蛋白水平上解决相关疾病的诊断和治疗等问题，目前已经取得一定的进展［7］。

    近年来，蛋白指纹图谱技术，也称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，SELDITOFMS)以其独特的技术优势广泛应用于临床研究［8］，在疾病诊断和疾病标志物发现等研究中显示出独特的作用［9～11］。本文拟就蛋白指纹图谱技术在肝病研究中的应用进展加以评述。

    1  SELDITOFMS简介

    SELDITOFMS技术结合了蛋白芯片和生物质谱技术，是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术［12～14］。该芯片设计的基本原理是：首先用生物或化学方法在载体表面制成点状芯池，再点入待检的生物样品，其中的蛋白分子通过其自身的生物或理化性质(亲水性、疏水性、金属络合及离子作用等)与芯片相结合，从而实现捕获、保留和纯化与之特异性结合的蛋白分子。接着用缓冲液洗脱未结合或非特异性结合的分子后再用激光脉冲进行轰击，即释放出靶点上的特异性蛋白分子。不同质荷比(m/z)的离子在电场中飞行的时间长短不一，分子量越大的离子在电场中飞行的时间越长，反之则越短。最后通过生物质谱(TOFMS)即可绘制出一张质谱图。该图经分析软件处理后还可形成模拟谱图，用于更直观地显示样品中各种蛋白质的相对分子质量、含量及磷酸化位点等信息［15，16］。

    蛋白质芯片根据表面物质的不同，可将其划分为化学型和生物型两类［17］。化学型芯片通过化学作用结合样品中的蛋白质，并根据其作用原理的不同又可进一步细分为疏水性芯片、亲水性芯片、阳离子芯片、阴离子芯片和金属亲和芯片等类型；生物型芯片则是把生物活性分子，如抗体、酶、受体、DNA等结合到芯片表面，借助抗原—抗体、酶—底物、受体—配体、蛋白质-DNA等相互作用结合样品中的蛋白质。生物芯片特异性高，还可以进行蛋白质定量。   

    2  SELDI技术与肝病研究

    作为蛋白质组学研究强有力的工具，目前SELDITOFMS技术在研究肝炎(chronic hepatitis)、肝硬化(hepatocellular cirrhosis)和肝癌(hepatocellular carcinoma)的蛋白指纹图谱表达及不同肝病之间的因果关系、演变规律及其特征表现，将为3种病的早期预警、诊断、治疗及预后提供依据，从而可能从根本上改变肝病的诊断和治疗水平。

    2.1  肝病的血清蛋白指纹图谱研究  目前各国学者都积极探索肝病的蛋白质组学研究，其中包括采用SELDITOFMS对各种不同的临床样本加以分析，旨在建立肝病的临床诊断方法，并发现新的肝病标志物。其中血清是最为常见的分析样本，也有采用SELDITOFMS技术来分析组织蛋白指纹图谱［18］。有关SELDITOFMS技术在肝病血清指纹图谱分析中的应用概况，见表1。从文献报道情况来看，多数报道均采用弱阳离子交换蛋白芯片和固相金属螯合蛋白芯片来获得肝病血清指纹图谱。表1  蛋白指纹图谱技术应用于肝病血清指纹图谱分析（略） 肝癌患者及健康人的血清   WCX2芯片   两组间有17个稳定的差异表达标志蛋白，其中有6个标志蛋白在肝癌患者血清中高表达，11个标志蛋白在肝癌患者血清中低表达。分析系统筛选出13752 Da及11472 Da标志蛋白建立肝癌的诊断模型，经盲法检测，对肝癌的诊断特异性为97.06%，敏感度为91.18%，阳性预测率为96.88%，获得较为满意的诊断结果［19］

    20例AFP<500 μg/L和38例肝癌患者的血清   IMACCu芯片和WCX2芯片   发现250余种蛋白质在肝癌和慢性肝病中表达明显不同。通过人工网络来鉴别慢性肝病与肝癌，结果用ROC曲线分析显示，全部样本AUC为0.91，AFP<500 μg/L者为0.954，在特异性为90%时其诊断敏感性达到92%。肿瘤特异性的标志物可用于肝癌的检测及分类［20］

    135例肝细胞癌患者血清，95例(其中33例为肝细胞癌伴门静脉癌栓，62例为肝细胞癌不伴门静脉癌栓)   WCX2芯片   16个蛋白峰差异有非常显著性(P<0.01)，6个蛋白在肝细胞癌伴门静脉癌栓组中上调，而10个蛋白在肝细胞癌伴门静脉癌栓组中下调；选择差异表达最明显的7个蛋白峰建立的决策树模型其敏感性为75.8%，特异性为82.3%；盲法验证该模型准确率为87.5%，灵敏性为100%，特异性为77.3%，阳性预测值为78.3%，阴性预测值为100%［21］

    84例HCC患者血清(有转移45例;无转移39例)   WCX2芯片   在转移和未转移的HCC患者血清中共检出的146个蛋白质峰，其中仅有11个蛋白质峰差异有非常显著性(P<0.01)［22］

    112例HCC患者血清   WCX2芯片   门静脉癌栓、肿瘤数目、肿瘤大小是影响肝细胞癌患者血清蛋白质指纹图谱的重要因素，而性别、肝硬化、甲胎蛋白对血清蛋白质指纹图谱没有明显影响［23］

    肝硬化患者和HCC患者血清   IMAC30-Cu芯片   通过人工神经网络方法建立诊断模型，灵敏性达94%，特异性达86%，采用LCMS/MS方法鉴定了2个蛋白，分别为kappa和lambda免疫球蛋白轻链［24］

    HCC患者、肝硬化患者、正常志愿者血清   WCX2芯片   运用人工神经网络方法建立诊断模型，诊断效果明显好于传统AFP方法［25，26］

    57例HCC;38例肝硬化;36例非硬化肝病患者;39例健康人血清   IMACCu   利用38个差异表达蛋白建立疾病诊断模型，可以用来区分HCC和肝病、肝硬化等肝类疾病［27］

    25例HBV-肝硬化;20例HCC患者;25例健康人血清      发现2个蛋白(m/z 7772与m/z 3933)只非肝硬化群体中表达，在HBV-肝硬化中没有检测到。笔者认为2个血清标志物可以用来诊断和评价疾病状况［28］

    2.2  肝病标志物研究  应用SELDITOFMS技术研究肝病蛋白指纹图谱，除了通过不同组间特异性蛋白的表达差异来建立疾病诊断模型，更为重要的是通过对特异性蛋白的鉴定，确定差异蛋白的成分，从而有目的地运用分子生物学技术对潜在生物标志物的生物功能进行分析，从而有助于肝病的病理研究，同时还可以作为疾病标志物用于疾病诊断、预后和疗效检测等。

    Paradis等［29］对38例肝硬化(非肝细胞癌)患者和44例肝细胞癌患者的血清用弱阴离子型芯片进行测定。发现有30个蛋白表达有明显不同。通过对6个差异水平最大的蛋白进行分析并建立HCC诊断模型，盲法验证准确率为92.5%，灵敏性为90%。并鉴定分子量为8900 Da的蛋白为V10 vitronectin的C末端。Lee［30］采用SELDITOFMS技术筛选慢性肝炎及肝癌的血清差异蛋白，质谱鉴定质量数为8900 Da的潜在标志物是Complement C3a蛋白，该蛋白在HCC中表达情况与PS20芯片及Western blotting两种方法的检测结果一致。

    丁守怡等［31］采用WCX2芯片及SELDITOFMS技术对体外培养肝细胞株HepG2和转染乙肝病毒的细胞株HepG2.2.15进行蛋白质指纹图谱检测分析，研究结果WCX2共捕获91个蛋白，其中差异表达蛋白共19个，有9个蛋白在HepG2细胞株中表达量升高，有10个蛋白在HepG2细胞株中表达量降低。并鉴定分子量为11081 Da的蛋白为钙结合蛋白S100A10。

    从目前报道来看，肝病标志物的研究还只是进行到潜在标志物的定性和表达研究这一层次，尚没有从蛋白功能的角度分析潜在标志物与肝病发生、恶化等环节间的相互联系，而全面了解这些相互联系正是疾病标志物应用于临床的前提。

    3  小结

    SELDITOFMS逐渐应用于肝癌标志物的研究中，其快速、高通量、准确的特点已经被广泛的认同。随着这项技术逐渐推向临床，也发现这项技术尚待完善，如差异蛋白的在线鉴定问题；如图谱中的峰高和蛋白质浓度之间的关系并非都是线性的；不同的研究者，由于检测过程中诸多因素的控制不一，对同种疾病得到的具有区分作用的峰是有差异的。所以SELDITOFMS要全面应用于临床研究，还需要在标准化、定性等问题上深入研究，在今后的实践过程中还有很多的问题需要解决，但SELDITOFMS技术必将成为快速诊断、发现并鉴定肿瘤标志物的有效手段。

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  作者单位： 102206 北京，北京蛋白质组研究中心

　  (编辑：巨  杨)