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【摘要】 目的 研究基质金属蛋白酶-2（MMP-2）启动子-790T/G、-735C/T等位基因多态性与吸烟人群慢性阻塞性肺疾病（COPD）易感性的关系。方法 研究对象为上海市肺科医院门诊和住院的患者，吸烟指数（每日吸烟支数×吸烟年数）＞400支年，肺功能正常，或吸烟但肺功能和胸CT提示COPD、肺大疱的患者。剔除合并心、肝、肾疾病、肿瘤和糖尿病的患者，记录患者吸烟指数、X线胸片或胸CT情况。测定肺功能。根据慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007年修订版）肺功能分级，将吸烟者分为COPD组、重度COPD组和正常对照组。重度COPD患者指Ⅲ级和Ⅳ级COPD患者。抽取入组者外周血3 ml，检测MMP-2启动子两组位点的基因型和等位基因的频率。结果 对照组30例，均为男性，平均年龄（60.1±8.7）岁，吸烟指数（888.67±305.96）支年，FEV1（2.69±0.54）L。COPD组32例，男31例，平均年龄（62.2±8.1）岁，吸烟指数（853.13±336.95）支年，FEV1（1.19±0.55）L（2例严重肺大疱未检查肺功能）。COPD组与对照组年龄和吸烟指数差异无显著性（P>0.05），两组研究对象的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的基因型频率无差异， P值分别是0.31和0.89，两组研究对象的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的等位基因频率均无差异，P值分别是0.35和0.87。重度COPD组与对照组的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的基因型频率也无差异，P值分别是0.97和0.71，两组研究对象的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的等位基因频率均无差异，P值分别是0.97和0.94。结论 上海地区吸烟人群中MMP-2启动子－790T/G和－735C/T多态性研究显示，该两个位点的基因型频率和等位基因频率与上海地区吸烟人群COPD的易患性无相关性。COPD肺功能下降程度与MMP-2基因型频率和等位基因频率无相关性。由于种族和地区差异，疾病易感基因的研究可能存在不一致性。
【关键词】 明胶酶A；基因多态性；慢性阻塞性肺疾病；易感性
Study on correlation between genetic polymorphism in matrix metalloproteinase-2 and susceptibility to smoking-related COPD
JIANG Ping，CHEN Bao,LI Xia,et al.Department of Respiratory Medicine,Shanghai Pulmonary Hospital，Shanghai 200433，China
［Abstract］ Objective To study the correlation between genetic polymorphism in matrix metalloproteinase-2 and susceptibility to smoking-related COPD.Methods The frequency of the genetype and the allele of two promoters of MMP-2 （-790T/G，-735C/T） in blood of outpatients and inpatients in our hospital were examined.The patients all had smoked cigarette which index were more than 400.These patients were divided into two groups（COPD group and control group） according to lung function of COPD guideline of China in 2007.Results In control group there were 30 men patients with average age 60.1±8.7 years,cigarette index was 888.67±305.96,FEV1 was 2.69±0.54 L.In COPD group there were 32 patients including one woman with average age 62.2±8.1 years,cigarette index was 853.13±336.95,FEV1 was 1.19±0.55 L（except 2 patients with severe bullae of lung）.The average age and the cigarette index had no differences between COPD group and control group.The frequency of the genetype of two promoters of MMP-2 （-790T/G，-735C/T） had no differences between two groups,P value was 0.31 and 0.89 respectively.The frequency of the allele of two promoters of MMP-2 （-790T/G，-735C/T） had no differences in two group,P value was 0.35 and 0.87 respectively.Similarly,the frequency of the genetype and allele of two promoters of MMP-2 （-790T/G，-735C/T） had no differences between severe COPD group and control group.Conclusion The genetic polymorphisms on -790T/G and -735C/T in matrix metalloproteinase-2 have no associativity to smoking-related COPD in Shanghai region of China.
［Key words］ gelatinase A;genetic polymorphism；COPD；susceptibility
吸烟是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的危险因素，但只有10％～15％的吸烟者发展为具有临床症状的 COPD，说明COPD患者体内存在遗传易感基因。在COPD的各种发病易患因素中，吸烟和蛋白酶与抗蛋白酶失衡是两个主要原因，其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）起主要作用。在MMP的启动子中发现有序列的突变［1］。目前研究发现MMP-1（间质胶原酶）、MMP-9（明胶酶B）、MMP-12（巨噬细胞弹性蛋白酶）在肺气肿发生中起重要作用［2］。国内有研究发现MMP-9启动子位点的多态性可能与中国南方汉族人群COPD易感性相关［3］。研究［4］发现COPD模型组MMP-2、MMP-9酶活性显著增高，表明MMP-2、MMP-9处于激活状态，其降解细胞外基质及破坏气道壁和肺泡结构的作用增强。目前对MMP-2启动子多态性研究较少。Vasku等发现在心脏功能衰竭患者中，MMP-2启动子-790T/G、-735C/T存在突变。本研究通过检测吸烟人群MMP-2启动子-790T/G、-735C/T等位基因的多态性，探讨该两位点基因多态性与吸烟人群中COPD易感性的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2006年12月～2007年4月在上海市肺科医院门诊或住院治疗的患者。入选条件：（1）年龄70岁以下（含70岁），愿意参加本研究的本院门诊或住院患者；（2）吸烟指数（每日吸烟支数×吸烟年数）＞400支年，肺功能正常，或吸烟但肺功能和胸CT提示COPD、肺大疱的患者。排除条件：（1）年龄70岁以上；（2）不愿意参加本研究；（3）已确诊肿瘤或不能排除肿瘤可能的患者；（4）严重心、肝肾功能不全或血液系统疾病患者；（5）有精神、神经系统疾病的患者。
1.2 研究方法 记录患者吸烟指数、X线胸片或胸CT情况。肺通气功能测定：测定用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气量（FEV1）、第1秒用力呼气率（FEV1/FVC）等参数。每次测定重复3次，误差低于5%，选取其中最佳者。多发肺大疱患者的肺功能可以不做。根据慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007年修订版）［5］肺功能分级，将吸烟者分为COPD组、重度COPD组和正常对照组。重度COPD患者指Ⅲ级和Ⅳ级COPD患者。
抽取入组者外周血3 ml，用EDTA K2抗凝试管反复均匀血标本，放在-20℃冰箱内保存。DNA的提取和测序由上海市鼎安生物科技有限公司完成。记录MMP-2启动子两组位点的基因型和等位基因的频率。血样基因组DNA提取过程：（1）血样本提取DNA由公司专业人员负责，把收集的DNA样品4 ℃保存。（2）聚合酶链反应：按文献合成MMP-2启动子的引物，正向引物序列是5＇-TAGCGTAAAATGAGCAGTGA，反向引物序列是5＇-CGCGTTAGAGACGTTGGAAC（由上海鼎安生物科技有限公司完成）。（3）PCR反应条件：条件是98 ℃ 2 min，96 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s,60 ℃ 4 min×35个循环,然后4℃放置。PCR反应体系：10×扩增缓冲液 Mg2+ 2.5 μl，每份2.5 mM的dNTP混合物2.5 μl，每条10 mM引物1 μl，DNA模版液1 μl，Taq （5 u/μl）0.2 μl，加双蒸馏水到25 μl。（4）测序：对每个研究对象的DNA样本的MMP-2启动子-790T/G、-735C/T进行测序，由上海市鼎安生物科技有限公司完成。记录各等位基因的频率。
1.3 统计学分析 用Hardy-Weinberg平衡法，检验各基因频率的代表性，统计学分析用SPSS 13.0软件包分析，两组间基因型频率和等位基因分布用χ2检验，对两组患者的年龄、吸烟量、肺功能进行非配对t检验，P<0.05具有统计学意义。
2 结果
对照组30例，均为男性，平均年龄（60.1±8.7）岁，吸烟指数（888.67±305.96）支年，FEV1（2.69±0.54）L。COPD组32例，男31例，平均年龄（62.2±8.1）岁，吸烟指数（853.13±336.95）支年，FEV1（1.19±0.55）L（其中2例严重肺大疱未检查肺功能）。两组年龄和吸烟指数差异无显著性，P>0.05。两组研究对象的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的基因型频率无差异，P值分别是0.31和0.89。两组研究对象的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的等位基因频率均无差异，P值分别是0.35和0.87，见表1。表1 COPD MMP-2基因多态性-790T/G和-735C/T基因型分布和等位基因频率重度COPD组与对照组的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的基因型频率也无差异，P值分别是0.97和0.71。两组研究对象的MMP-2启动子-790T/G和-735C/T的等位基因频率均无差异。P值分别是0.97和0.94，见表2。吸烟人群MMP-2启动子-790T/G、-735C/T等位基因的序列见图1。表2 重度COPD MMP-2基因多态性-790T/G和-735C/T基因型分布和等位基因频率
3 讨论
以胶原为主的细胞外基质（ECM）在气道壁过度沉积是COPD气道重塑的重要病理改变，是引起气道壁纤维化、气流阻塞的主要原因之一。MMPs是降解细胞外基质的主要蛋白酶。MMP可由正常组织细胞和炎症及肿瘤细胞产生,其中明胶酶又称Ⅳ型胶原酶，包括明胶酶A和明胶酶B，MMP-2为明胶酶A,其主要作用底物为Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、变性的胶原、纤维粘连蛋白和弹性蛋白等。
国外研究表明MMP-1、MMP-9和MMP-12基因多态性对COPD的发病进程起重要作用，但对于MMP-2启动子多态性对COPD易感性的研究未见报道。Vasku等发现，在慢性心功能衰竭的患者中，MMP-2启动子-790T/G的T等位基因和-735C/T的C等位基因频率显著增加，该两个位点的等位基因具有多态性。本研究通过对上海地区吸烟人群中MMP-2启动子-790T/G和-735C/T多态性研究，初步显示该两个位点的基因型频率和等位基因频率与上海地区吸烟人群COPD的易患性无相关性。吸烟人群中患COPD者的肺功能下降程度与MMP-2基因型频率和等位基因频率无相关性。
有研究认为MMP-9启动子位点的多态性可能与中国南方汉族人群COPD易感性相关。但也有研究报道［6］认为，在与吸烟相关的COPD人群中，MMP-1和MMP-12基因多态性与肺功能快速下降相关，而MMP-9无显著相关。Joos和Minematsu对MMP-9的-1562T基因多态性是否和COPD有关的研究结果不一致，可能与种族差异和地理环境的不同有关［7］。本研究MMP-2启动子-790T/G和-735C/T多态性与吸烟人群中COPD易感性的关系是否也有类似原因，尚需大样本的进一步证实。COPD模型组肺组织中MMP-2、MMP-9酶活性显著增高，其降解细胞外基质及破坏气道壁和肺泡结构的作用增强。导致此类酶活性增高的原因，可能与酶启动子多态性有关，也可能是同一酶系酶之间的相互关系的结果。本研究的结果与Vasku等学者的研究结果不同，可能与人种和疾病的不同有关。
COPD是具有多基因遗传倾向的慢性疾病，发病与多个易感基因有关。研究相关基因在COPD致病中的作用和相互关系，有利于在基因水平研究致病机制，对COPD的预防和治疗具有重要意义。但是应该注意到，由于种族和地区差异，易感基因的研究结论存在不一致性。
【参考文献】
1 Ye S.Polymorphism in matrix metalloproteinase gene promoters:implication in regulation of gene expression and susceptibility of various diseases.Matrix Biol,2000，19（7）：623-629.
2 Ladina Joos,Jian-Qing He,Megan B，et al.The role of matrix metalloproteinase polymorphisms in the rate of decline in lung function.Human Molecular Genetics,2002，11（5）：569-576.
3 周敏，黄绍光，万欢英，等.中国南方汉族人MMP-9基因多态性与COPD易感性的关系.上海第二医科大学学报，2004，24（2）：81-84.
4 李红梅，崔德健，佟欣，等.基质金属蛋白酶在大鼠慢性阻塞性肺疾病模型气道细胞外基质重塑中的作用.中华内科杂志，2002，41（6）：393-398.
5 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007年修订版）.中华结核和呼吸杂志，2007，30（1）：8-17.
6 Joos L，He JQ，Shepherdson MB.The role of matrix metalloproteinase polymorphisms in the rate of decline in lung function.Hum-Mol-Genet，2002，11（5）：569-576.
7 张卫强，王云杰.基质金属蛋白酶的基因多态性和慢性阻塞性肺疾病及肺癌的关系.国外医学·呼吸系统分册，2005，25（3）：331-333.
作者单位：200433 上海，上海市肺科医院肺内科