TNFα、CD54在肝纤维化家兔肝移植中的表达及意义

【摘要】  目的　　探讨肿瘤坏死因子-α（TNFα）、细胞间粘附分子-1（CD54）在肝纤维化家兔肝移植中的表达及意义。方法　　普通成年家兔30只，随机分为正常组5只，供体组10只，对照组5只，实验组10只。实验组应用四氯化碳（CCl4）法建立肝纤维化动物模型。然后，正常组给予假手术，对照组和实验组采用原位肝移植手术。术后24h处死所有实验动物，应用免疫组织化学的方法，检测各组肝脏组织中TNFα、CD54的表达。结果　　实验组TNFα、CD54的表达均比对照组和正常组明显增加（P<0.05）；对照组CD54表达比正常组增加（P<0.05）；对照组TNFα的表达与正常组无明显差异（P＞0.05）。结论　　TNFα、CD54在肝纤维化家兔肝移植中发挥重要作用，可能影响移植肝脏的损伤修复。

【关键词】  肝移植 肝纤维化 TNFα CD54

    Expression and significance of TNFα and CD54 on liver tissue from liver transplantation rabbit with hepatic fibrosis

    LIU Baomin.Medical Department,Peoples Hospital of Qihe,Qihe 251100,China

    ［Abstract］　　Objective　　To study of the expression and its significance of TNFα and CD54 on liver tissue from liver transplantation rabbit with hepatic fibrosis.Methods　　Thirty adult rabbits were divided randomly into four groups,five rabbits were in ten normal group （NG）,ten in the donator,five in the control group （CG）,and ten in the experimental group （EG）.Carbon tetrachloride was injected intraperitoneally to make the hepatic fibrosis model of the rabbit in EG.Then NG was given sham operation,CG and EG were given liver transplantation operation.After operation 24 hours,all of the rabbits were executed,and immunohistochemistry staining was adopted to observe the positive expression of TNFα and CD54 molecular in liver tissue.Results　　The positive expression of TNFα and CD54 molecular in EG were significantly higher than that in NG and CG（P＜0.05）,and the positive expression of CD54 molecular in CG was higher than that in NG （P＜0.05）,but the expression of TNFα in CG was similar as in NG （P＞0.05）.Conclusion　　The positive expression of TNFα and CD54 on liver tissue from liver transplantation rabbit with hepatic fibrosis has important effect,which possibly impacts the reparation of transplanted liver.

    ［Key words］　　liver transplantation;hepatic fibrosis;TNFα;CD54

    　　　　肝移植已成为治疗终末期肝病的唯一有效手段，但相对于其他外科手术来说，其风险仍然很大。排斥反应及原发性移植肝无功能已成为肝移植手术失败的主要原因。目前，国内外的研究方向主要是肝移植后的缺血再灌注损伤及移植排斥反应。本实验通过建立肝纤维化家兔模型，再施行肝移植，探讨肝纤维化家兔血液中的细胞因子对移植肝脏的作用。

    1　　材料与方法

    1.1　　实验动物及分组　　选取6月龄普通级雄性家兔30只，由青岛市药检所提供，体重1.75～2.25kg。随机分为正常组5只，供体组10只，对照组5只，实验组10只。正常组给予假手术，对照组和实验组采用原位肝移植手术。在不锈钢丝笼中饲养，早晚喂颗粒状饲料（青岛市药检所提供），中午喂青菜，自由饮用自来水。空气湿度为50％～70％，温度为20～29℃。

    1.2　　肝纤维化动物模型的建立［1］　　家兔饲养5天后开始造模。将四氯化碳（上海建信化工有限公司试剂厂）溶于菜籽色拉油中摇匀，使浓度为5％。高压消毒。取四氯化碳按0.1ml/kg行腹腔注射。开始每周一次行腹腔注射；4周后，根据动物的情况每周注射2次，四氯化碳剂量为0.14～0.26ml/kg，浓度为7％～13％。8周后行肝移植手术。

    1.3　　肝移植动物模型的建立　　术前2h禁食，戊巴比妥钠30mg/kg耳缘静脉麻醉后，自腹正中切开腹腔，充分游离并显露左肾动、静脉。将两根长12 cm、内径3mm且充满肝素盐水的硅胶管分别由左肾动、静脉插入腹主动脉及下腔静脉内，钳夹游离端，备用。将待灌注的供肝门静脉及肝下下腔静脉依次与相应受体兔的肾动、静脉插管连接（此前结扎供肝的肝动脉及肝上下腔静脉），解除插管钳夹，恢复供肝血流［2］。供体组兔肝脏（供肝）的原位灌注及切取按Jamieson等［3］介绍的方法进行。假手术仅做肝脏及周围血管的游离。

    1.4　　标本取材及染色　　24h后采用空气栓塞处死动物，切取左外叶肝组织标本。于40g／L多聚甲醛固定液中固定6h。固定后的组织常规浸蜡包埋、连续切片。应用免疫组织化学SABC三步法染色，检测TNFα、CD54在各组肝脏组织中的表达，DAB显色，镜下控制显色时间。最后脱水，透明，封片，显微镜观察。

    1.5　　免疫组化测定　　免疫组化染色结果利用美国Sample PCI图像分析系统进行平均吸光度测定，将免疫组化染色结果转化为平均吸光度值进行定量分析。每张切片以组织间质空白处入射光的值为定标。每张切片测定5个视野吸光度取平均值，以其作为切片的测定值。切片阳性表达的强弱与吸光度值呈正相关。TNFα、CD54均表达在染色阳性细胞的胞浆或胞膜呈现程度不同、基本均匀的棕黄色颗粒。

    1.6　　统计学处理　　所有数据均用SPSS 13.0进行统计学分析。取α=0.05为检验水准，P<0.05表示差异有显著性。

    2　　结果

    2.1　　病理改变　　大体见正常组家兔肝脏呈鲜红色，有光泽，质地柔软；实验组动物肝脏呈灰白色，无光泽，被膜肿胀,且质地变硬。HE染色可见光镜下正常组肝细胞呈条索状排列，形态无明显改变；对照组肝细胞轻度肿胀，部分细胞呈气球样变，主要位于小叶中央静脉周围；实验组肝细胞肿胀，肝窦扭曲、闭塞、狭窄，汇管区有中性粒细胞浸润，肝细胞增生及假小叶形成。

    2.2　　TNFα、CD54检测结果　　TNFα表达在染色阳性肝细胞的胞浆，CD54表达在染色阳性的肝细胞的胞膜，呈现程度不同、基本均匀的棕黄色颗粒。见表1。表1　　TNFα、CD54各组阳性表达的平均光密度注：*术中1只死亡。△建立肝纤维化模型时3只死亡，术中1只死亡。实验组与对照组及正常组比较，**P<0.05；对照组与正常组比较，△△P>0.05；实验组、对照组及正常组之间比较，P均<0.05

    3　　讨论

    肝移植是治疗终末期肝病的有效手段，但其风险很大。排斥反应及原发性移植肝无功能已成为肝移植手术失败的主要原因。目前，国内外的研究方向主要是肝移植后的缺血再灌注损伤及移植排斥反应。本实验通过建立肝纤维化家兔模型，再施行肝移植，探讨肝纤维化家兔血液中的细胞因子对移植肝脏的作用。

    TNFα是免疫反应中重要的炎症因子，在免疫反应激活后大量产生并被广泛研究，它可以介导白细胞粘附于血管内皮细胞，从而刺激机体局部炎症反应，并刺激单核细胞及其他细胞产生细胞因子，包括IL-1、IL-6及TNF本身等一些低分子炎性细胞因子，还可激活T细胞和刺激B细胞产生抗体。牛春红等［4］研究表明TNFα在肝纤维化大鼠血浆中的含量升高，可损伤肝细胞、诱发炎症反应，并可促进纤维增生。许多研究者发现在肝脏等同种器官移植急性排斥反应时受体TNFα水平都有提高［5］。在本实验中，对照组术后24h，肝细胞浆中TNFα的表达与正常组无明显差异，这与杨哲等［6］的研究结果相同。表明肝移植后因手术创伤、应激反应、缺血再灌注损伤及排斥反应等原因所引起的TNFα表达的改变已降至术前水平；而实验组TNFα的表达比正常组和对照组明显升高（P<0.05），这说明肝纤维化家兔体内的TNFα水平可能影响移植肝脏的损伤修复及再生。

    CD54为单链跨膜糖蛋白，正常情况下很少表达或不表达，当受到炎性细胞因子（如TNFα，IL1、IFNγ等）、内毒素等刺激时呈高水平表达，介导免疫效应细胞与多种细胞及免疫细胞间的相互作用，在机体免疫系统中起重要作用。陈耿臻等［7］研究表明大鼠移植肝组织中CD54在肝细胞膜、胆管上皮细胞及炎性浸润细胞上明显表达，在中央静脉内皮上呈低表达，而正常肝细胞中无CD54的表达。在本实验中，对照组肝细胞膜上CD54的表达比正常组明显升高（P＜0.05），这与前者的结果相同，说明CD54的表达与肝移植后炎性排斥反应有关；而实验组CD54的表达与对照组比较明显升高（P<0.05），这可能与肝纤维化家兔血浆中TNFα的升高有关。实验组CD54表达明显升高，可能是因为移植后炎性排斥反应较重。这可能导致移植肝脏衰竭。

    总之，肝纤维化家兔肝移植后肝细胞TNFα、CD54的表达明显升高，可能与肝纤维化家兔血浆中TNFα的升高有关，并可能影响移植肝脏的损伤修复。

【参考文献】
  1　　胡晓峰，刘斌，张敏，等.家兔肝纤维化模型的建立及肝功能指标与肝纤维化的相关性.实用肝脏病杂志，2007，10（3）：152-154.

2　　汤礼军，田伏洲，王雨，等.兔肝冷保存后复温缺血-再灌注损伤及其相关机制的研究.Chinese Journal of Pathophysiology,2001,17（2）:161-163.

3　　Jamieson NV,Lindell S,Sundberg R,et al.An analysis of the components in UW shlution using the isolated perfused rabbit liver.Transplantation,1988,46（4）:512-516.

4　　牛春红，韩德五，刘近春，等.TNFα和IL-10在肝硬化发生发展中动态变化的研究.Chinese Journal of Pathophysiology,2006,22（12）:2469-2470；2473.

5　　Freeman RB,Tran CL,Mattoli J,et al.Tumor necrosis factor genetic polymorphisms correlate with infections after live transplantation.Transplantation,1999,67:1005-1010.

6　　杨哲，陈仲清，蒋晓清.原位肝移植围手术期血清TNFα、IL-6、IL-10的变化.解放军医学杂志，2006，31（9）：901-903.

7　　陈耿臻，沈文律，夏仁品，等.ICAM-1在同种大鼠肝移植物中的表达及其意义.四川医学，2005，26（10）：1060-1061.

作者单位：251100 山东齐河，齐河县人民医院