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【摘要】 目的 探索外周血多药耐受（MDR）基因表达与难治性癫痫耐药性的关系。方法 用流式细胞仪检测癫痫病人血中P-糖蛋白（Pgp）的表达。结果 难治性癫痫组血清Pgp明显高于癫痫治疗有效组和正常对照组。结论 Pgp在癫痫耐药的发病机制中起重要作用, 其在外周血的高表达可作为癫痫患者耐药的一个客观指标。
【关键词】 难治性癫痫；P糖蛋白; 流式细胞术
The clinical significance of expression of multidrug resistance gene in the peripheral blood of patients with epileptic
YANG Mei-lan, CHEN Xiao-yan, ZHANG Yun-qi, et al. Department of Neurology, the Forth Hospital of Shenzhen, Guangdong 518003, China
［Abstract］ Objective To explore the relationship between the overexpression of multidrug resistance gene （MDR） in the peripheral blood of patients with epileptic and the drug resistance of the intractable epilepsy （IE）.Methods The expression of P- glycoprotein （Pgp） in the peripheral blood of patients with IE was detected by flow cytometer （FCM）, and was compared with those of healthy subjects and epilepsy patients ,which reacted well to medicine.Results The level of Pgp in the serum of IE group was significantly higher than those in epilepsy group and normal control group.Conclusion The overexpression of Pgp may play an important role in the drug resistance of IE, and can be considered as an objective index for drug resistance in patients with IE.
［Key words］ intractable epilepsy; P -glycoprotein；flow cytometer
难治性癫痫（Intractable Epilepsy简称IE）是神经学科研究的热点及难点之一，癫痫耐药是一个由多种因素参与的复杂过程, 而癫痫发作呈随机性、多样性，现行的IE诊断［1］需要经过长期的临床实践才能诊断，故极易误诊或漏诊。既往的研究主要从病人手术切除或动物模型的脑组织着手，取材的限制严重影响临床研究的开展及深入。本研究利用半定量的流式细胞仪技术检测癫痫患者外周血中Pgp的表达以探讨MDR在IE中的作用。
1 对象与方法
1.1 病例的选择和分组 全部病例均来自2004—2008年深圳第四人民医院神经内科就诊的癫痫患者。病例组分为3组, 每组均为16例: （1）IE组（A组）: 男9例，女7例, 年龄10～46岁, 病史3～9年，均有典型癫痫发作史及脑电图表现, 符合IE诊断［1］，现联用两种一线AEDs, 检测AEDs均在正常范围; （2）药物治疗有效组（B组）: 男女各8例, 年龄12～49岁，病史2～6年，均有典型癫痫发作史及脑电图表现, 经一线AEDs正规治疗2年未发作, 至少半年未发作, 排除其他中枢神经系统疾病或占位病变；（3）健康对照组（C组）: 16名, 为本院无癫痫及其他重大疾病的健康体检者, 均无癫痫发作史，男女各8例, 年龄14～52岁。
1.2 主要实验试剂及设备 购自Beckman Coulter公司的Pgp单克隆抗体CD243-PE、IgG2a-PE、溶血素（Lysing solution）及库尔特Epics XL型流式细胞仪。
1.3 实验方法 全部标本用流式细胞仪按下列方法［ 2 ］ 检测Pgp的表达相对量: （1）在检测管和同型对照管中加入肝素抗凝血100μl后, 检测管中加入CD243-PE 20μl, 对照管中加入IgG2a-PE 20μl, 混匀后室温下避光孵育30min; （2）加入溶血素溶血10min; （3） PBS洗涤2次; （4）用流式细胞仪以淋巴细胞设门, 收集1万个白细胞, 用CELL QUEST统计软件计算Pgp表达阳性的细胞百分数。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计处理, 数据用（x±s）表示, 行ANOVA分析法中的LSD法进行检验分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
见表1。 表1 三组P-糖蛋白表达的相对量注：CBZ：卡马西平；VPA：丙戊酸钠；PHT：苯妥英钠。年龄、性别、病程均无统计学差异，A组与B组的AEDs无统计学差异。*表示Pgp表达量B、 C组与对照组比较差异有显著性（P<0.05） , ▲表示B、C组比较差异无显著性（P>0.05）。
3 讨论
癫痫的耐药机制形成复杂, 至今尚未完全阐明。在临床实践中人们发现如果患者对某种AEDs耐受, 往往对其他具有不同化学结构、不同作用途径、不同作用机制的一线AEDs也不敏感，于是人们猜测IE的耐药很可能是一种共同的、非特异性的耐药机制，即多药耐药 （Multidrug Resistance, MDR）机制，并提出了IE的耐药机制假说-多药转运蛋白学说 （multidrug transporter hypothesis）, 此学说认为Pgp的高表达可使AEDs在癫痫病灶的浓度过低, 从而导致耐药 ［ 3 ］。
人类MDR基因族由MDR1、MDR3组成, 研究表明细胞耐药性由MDR1起主导作用, 其表型是分子量为170000的Pgp, 由1280个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，含有两个由链区连接的相同亚基, 每个亚基都有6个疏水跨膜区和一个ATP结合位点, 是一种能量依赖性外排泵。在中枢神经系统中, Pgp广泛存在于脑毛细血管内皮细胞、脑实质的星形胶质细胞的足突, 以及大脑毛细血管质膜、蛋白质的合成、糖基化和膜转运等场所。在生理状态下Pgp可阻止外源性毒素入侵, 清除内源性有毒物质, 维持内环境的稳定，因此正常人亦可有一定的表达［ 4 ］，本研究与之相符。当机体处于某种病理情况下（如癫痫）, 脑内内环境的改变可导致血脑屏障完整性暂时被破坏, 此时Pgp的表达发生变化，在毛细血管内皮细胞的表达限制了AEDs进入脑内，从而降低脑内药物浓度，而在神经胶质细胞和神经元细胞的表达可能阻碍了细胞内AEDs的药物作用，使其耐药。
由于IE严重影响人们的生活质量，研究者对IE做了大量的工作。Brandt等［5］研究发现对苯巴比妥耐药大鼠的海马及边缘叶Pgp显著高表达，加用Pgp拮抗剂后可恢复PB的抗癫痫作用，认为Pgp的高表达参与了IE的形成，痫性活动可促进MDR1基因的高表达, 而与AEDs作用无关。也有研究［6，7］认为Pgp高表达与癫痫发作及药物作用均有关。本研究发现IE患者外周血中Pgp表达明显高于其他两组, 提示MRP耐药机制中起到了重要的作用; 药物治疗有效组Pgp表达与健康对照组比较无统计学差异, 提示单纯的药物诱导和癫痫发作本身并不能引起外周血中MRP1的上调, 其上调可能是多种因素、多种机制、多途径、多环节共同作用的结果。因此，我们在处理IE患者方面应从多途径、多种作用机制的药物着手，这也是目前新型AEDs不断问世的作用点及突破口。
鉴于AEDs经血入脑, 血中有药理作用的AEDs游离浓度与脑内起抗癫痫作用的药物浓度呈正相关关系, 检测其外周血中MDR表达可同步反映其脑组织中MDR表达水平。且外周血取材方便、可重复性强，便于临床研究、指导诊治，故检测其Pgp表达有助于对药物或手术治疗进行适时监控及指导，对IE的发病机制及临床研究具有极高的价值。但是由于MDR基因具有多态性，如何把握Pgp表达和功能与疾病易感性和特异性之间的关系以及安全调节Pgp功能到安全状态尚有待进一步研究。
【参考文献】
1 郭玉璞,王维治. 神经病学，第2版. 北京:人民卫生出版社, 2006，1047-1058.
2 Lazarowski A , Sevlever G, Taratuto A, et al. Tuberous sclerosis associated with MDR1 gene expression and drug-resistant epilepsy. Pediatr Neurol, 1999, 21（4）: 731-734.
3 Bankstahl JP, Hoffmann K, Bethmann K, et al. Glutamate is critically involved in seizure-induced overexpression of P-glycoprotein in the brain. Neuropharmacology,2008,54（6）:1006-1016.
4 宋玉华，罗兵，佟琳如. 多药耐药相关蛋白基因在进行白血病中的表达. 青岛大学医学院学报，2001,37：412-413.
5 Brandt C, Bethmann K, Gastens AM, et al.The multidrug transporter hypothesis of drug resistance in epilepsy: Proof-of-principle in a rat model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis,2006, 24（1）: 202-211.
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7 Baltes S, Gastens AM, Fedrowitz M, et al. Differences in the transport of the antiepileptic drugs phenytoin, levetiracetam and carbamazepine by human and mouse P-glycoprotein. Neuropharmacology, 2007, 52（2）: 333-346.
作者单位：518003 广东深圳，深圳市第四人民医院神经内科（△研究所）