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【摘要】 目的 研究GPI-PLD 基因转染并过度表达对SW579细胞的影响。方法 用脂质体转染法将GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1（+）/GPI-PLD转入SW579细胞,以未转染的SW579细胞及转染空载体pcDNA3.1（+）的细胞为对照,筛选出阳性细胞克隆。以胎盘碱性磷酸酶为底物,定量检测GPI-PLD活性,RT-PCR法确定GPI-PLD mRNA表达水平。细胞计数绘制生长曲线,台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒（CDC）杀伤率,ELISA检测癌胚抗原（CEA）的表达情况。结果 阳性细胞克隆GPI-PLD酶活性水平比对照组升高约3倍,GPI-PLD mRNA表达水平约增加6倍；GPI-PLD基因过度表达可促进GPI锚定的蛋白质如CEA和PLAP等被大量水解释放入培养基,导致细胞增殖能力减弱,对补体杀伤的敏感性增强。结论 成功将GPI-PLD 基因转染入SW579细胞,并在细胞中稳定表达。GPI-PLD过表达能抑制肿瘤细胞增殖,增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性。
【关键词】 糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D；甲状腺癌；SW579细胞；转基因
Effect of overexpression of glycosyl phosphatidyl inositol specific phospholipase D on biological character of thyroid carcinoma cell line SW579
HAO Shu-hua.The People’s Hospital of Yiyang City, Hunan 413001，China
［Abstract］ Objective To investigate the effect of overexpression of glycosyl phosphatidyl inositol specific phospholipase D （GPI-PLD） on the biological character of thyroid carcinoma cell line SW579. Methods The GPI-PLD gene eukaryon expression vector pcDNA3.1 （+）/GPI-PLD was transiently transfected into SW579 cell by lipid media transfection. The untransfected SW579 and SW579 transfected with pcDNA3.1 （+） were used as controls. After screening with G418, the single clone was obtained. The expression level of GPI-PLD mRNA in SW579 was identified by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. GPI-PLD activities were analyzed quantitatively by TX-114 partition with GPI anchored placental alkaline phosphatase （PLAP） as a substrate. Cell count was used to detect the proliferation in 3 groups, and complement dependent cytotoxicity （CDC） effects were observed by the staining of trypan blue. Carcinoembryonic antigen （CEACAM5） was detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results As compared with SW579 and pcDNA3.1 （+）/SW579 cell, the levels of GPI-PLD activities and its mRNA from pcDNA3.1 （+）/GPI-PLD/SW579 were increased with almost 3 to 6 times respectively. The GPI anchored PLAP and CEACAM5 released into the medium by GPI-PLD, and the rate of CDC killing on the cells were significantly increased. However, the proliferative capacity was obviously decreased. Conclusion The stable cell line with overexpression of GPI-PLD has been constructed. The overexpression of GPI-PLD in these cells increases the sensitivity of these cells to CDC killing and impairs the proliferative capacity of cells.
［Key words］ glycosyl phosphatidyl inositol specific phospholipase D; thyroid carcinoma; SW579 cell; transgene
甲状腺癌是头颈部常见恶性肿瘤，占全身肿瘤的1%～2%，可发生于任何年龄，30～40岁为发病高峰期，女性多见，潜伏期长，生长缓慢，转移早，在地方性结节性甲状腺肿流行区，甲状腺癌特别是低分化甲状腺癌的发病率也很高，全面阐明甲状腺癌的发病机制,对于临床诊断和治疗十分重要。研究发现一些糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定蛋白质已经成为甲状腺癌的肿瘤标志物,如GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）［1］和癌胚抗原（CEA）等［2］。目前在人体内经分子生物学证实的只有糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D,GPI-PLD）能在特定的情况下特异性水解GPI锚定蛋白中的肌醇磷酸脂键,释放细胞质膜上的锚定蛋白［3］。本课题在预实验中发现甲状腺癌细胞株SW579的GPI-PLD酶活性低下。这些研究提示甲状腺癌细胞的GPI-PLD活性降低,导致GPI锚定蛋白水解释放相应减少,可能在甲状腺癌发病机制中起作用。但GPI-PLD及GPI锚定蛋白质是否影响甲状腺癌细胞的生长、增殖、凋亡等生物学特征,目前尚无实验证据。本研究通过稳定转染GPI-PLD基因,从甲状腺癌细胞增殖、凋亡及补体对肿瘤细胞的杀伤作用这三个方面来观察GPI-PLD基因过表达对SW579细胞的作用,为探讨甲状腺癌的发病机制和可能的基因治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 甲状腺癌细胞SW579购买于武汉大学细胞宝藏中心。大肠杆菌DH5α为本室保存菌种,重组的真核细胞表达型质粒pcDNA3.1（+）/GPI-PLD由周俊涛博士馈赠。兔抗人β-actin抗体购自湖南长沙科泰生物公司,逆转率试剂盒购自英俊生物公司,为MBI公司产品，质粒提取试剂盒购自BMI公司,碱性磷酸酶测定试剂盒为Promega公司,CEA定量ELISA试剂盒为Sigma公司产品。
1.2 重组质粒pcDNA3.1（+）/GPI-PLD转染SW579细胞、筛选并鉴定 设立pcDNA3.1（+）/GPI-PLD,pcDNA3.1（+）空白载体及空白对照组，按照脂质体使用说明进行转染，用G418筛选,获得阳性克隆,RT-PCR检测GPI-PLD mRNA表达水平，GPI-PLD引物:正向5’-TTCACGGCTCCTATTCA-3’,反向5’-TTCAGTTAGGGATGTAGTCA-3’，扩增片断大小为494bp。以GAPDH为内对照。
1.3 GPI-PLD酶活性水平测定 用购买自Sigma公司的完整GPI结构的胎盘碱性磷酸酶（PLAP）为底物，通过TX-114分相,定量检测转染细胞中GPI-PLD活性。具体步骤按已经报道的方法进行［4］。GPI-PLD酶活性计算公式为：
GPI-PLD酶活性=［（待测组W管吸光度值×待测组水相体积）/（待测组T管吸光值×待测组总体积）-（对照组W管吸光度值×对照组水相体积）/（对照组T管吸光度值×对照组总体积）］×100%
1.4 分光光度法测定GPI锚定PLAP 细胞培养48h后，收集培养液和细胞，超声波粉碎细胞后离心收集上清液。按试剂盒使用说明步骤加入加缓冲液和基质液, 37℃水浴1min后加入1.5ml显色剂,立即混匀,空白管调零,520nm处测定各管吸光度。按照下面公式计算胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）的活性：碱性磷酸酶活性=测定管吸光度 标准管吸光度×标准管含酚的量×100ml 0.5ml
1.5 ELISA检测GPI锚定CEA 细胞培养48h后，收集培养液，按试剂盒使用说明步骤加入试剂,在酶标仪上用空白孔调零,读取450nm处的吸光度。结果计算：以CEA标准浓度用SPSS11.0软件求解其直线回归方程,再根据标本的平均OD450值代入直线回归方程,求出样本的CEA浓度。
1.6 生长曲线测定 取对数生长期的细胞,制成单细胞悬液,分别接种于24孔板中,每孔接种1.0×104个细胞，每3天换1次培养基。接种后第2、4、6、8和10天每种细胞随机取3孔，进行细胞计数，按时间及每孔平均数绘制生长曲线。
1.7 补体介导的细胞毒实验 获取细胞,加入兔抗人β-actin抗体,37℃孵育40min。取样5μl与等量0.4%台盼蓝混匀、染色,迅速镜检200个细胞,计数死细胞数并换算成杀伤率。
1.8 统计学处理 数据以均数±标准差表示,采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理,组间数据比较采用t检验,P＜0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 RT-PCR 法检测GPI-PLD mRNA的表达水平 RT-PCR检测发现,稳定转染重组质粒的SW579细胞组（pcDNA/GPI-PLD组）的GPI-PLD mRNA 表达上调（图1A）。灰度扫描结果表明,转染组与转染空载体组（pcDNA3.1组）和未转染的SW579细胞组（Control组）相比,其GPI-PLD mRNA 的表达水平增加明显增加,差异具有显著性（P＜0.05）（图1B）;而转染空载体组SW579细胞与未转染组SW579细胞相比,GPI-PLD mRNA的表达无明显变化（图1B）。该结果表明高表达GPI-PLD mRNA的SW579细胞株构建成功。图1 GPI-PLD在转染有GPI-PLD的SW579细胞中mRNA水平的表达：A为GPI-PLD在不同SW579细胞株中表达的凝胶电泳结果，B为凝胶电泳灰度扫描结果。*表示P＜0.05
2.2 细胞GPI-PLD酶活性测定结果 培养各组细胞48h，测定GPI-PLD酶活性水平,共测定9次。转染组（pcDNA/GPI-PLD组）与其他两组［转染空载体组（pcDNA3.1组）］和未转染的SW579细胞组（Control组）相比，其GPI-PLD 酶活性水平增加3～4倍,差异有显著性（P＜0.01），转染空载体组和未转染的SW579组差异无显著性（P>0.05）（图2）。
2.3 GPI锚定PLAP释放检测 转染空载体和未转染的两组SW579细胞, 其PLAP 活性主要分布于细胞上，而阳性转染组PLAP活性则大部分分布于细胞培养液中,而且其细胞PLAP 总活性高于前两组细胞（图3）。
2.4 不同SW579细胞释放GPI锚定CEA水平测定 细胞培养48h后,转染组（pcDNA/GPI-PLD组）较转染空载体组（pcDNA3.1组）和未转染组（Control组）的SW579细胞,其培养基上清液中CEA浓度显著提高，差异有显著性（P＜0.01）,增高水平达9倍。而转染空载体组和未转染的SW579细胞组比较，差异无显著性（见表1）。表1 不同SW579细胞培养液中CEA浓度测定 注：*P＜0.05
2.5 不同SW579细胞株生长速度观察 细胞计数显示转染有GPI-PLD组 （pcDNA/GPI-PLD组） 的SW579细胞生长速度较转染空白载体组（pcDNA3.1组）和未转染组（Control组）明显减慢，差异具有显著性（P＜0.05）（图4）。
图4 不同SW579细胞株生长曲线分析
2.6 补体介导的细胞毒试验 细胞培养48h后,稳定转染细胞较阴性对照自然死亡后被台盼蓝染色的细胞而言, 转基因的细胞被补体杀伤时,细胞肿大更加明显, 胞膜边界也更加模糊, 证明补体对这些细胞有明显杀伤作用。补体介导的细胞毒（CDC）杀伤率显示,pcDNA/GPI-PLD组较pcDNA3.1组和Control组细胞组杀伤率显著增高,增高倍数超过了3倍, 而pcDNA3.1组和Control组细胞组间差异无显著性（见表2）。表2 补体介导的细胞毒实验对不同SW579细胞杀伤率的比较 注：*P＜0.01
3 讨论
本研究结果显示, GPI-PLD基因过度表达可抑制SW579细胞的生长, 推测其分子机制可能是GPI-PLD基因表达增强,使GPI-PLD 酶活性增加,水解释放细胞膜上GPI锚定的蛋白质如CD87、 CD55、 CD59、PLAP、CEA和CEACAM6等增加, 改变了这些GPI锚定蛋白质的功能和信号传递途径。已经发现GPI锚定蛋白质、糖脂、胆固醇和小窝蛋白等以脂质微域形式富集于细胞质膜的特定区域-小窝内,而很多信息传递通路包括G蛋白介导途径、Ca2+介导途径、酪氨酸激酶途径等中的大量信息传递通路蛋白富集于小窝内［5］。因此, GPI锚定蛋白质的释放可能影响到该蛋白质的生物学作用和脂质微域的信号转导。比如 GPI锚定CD87（uPAR ）在许多肿瘤组织的细胞表面高表达, 他们参与调控癌细胞的增殖、分化、黏附、迁移和浸润。有报道,uPA与GPI锚定uPAR 结合后,可将无活性的纤溶酶原转化成为有活性的纤溶酶, 直接或间接降解细胞外基质蛋白,有助于肿瘤细胞的浸润和转移; GPI-PLD 释放的可溶性uPAR 则能清除uPA,减少纤溶酶的生成, 抑制肿瘤细胞的生长和转移［6］。人类很对肿瘤组织都过度表达CEA和CEACAM6,推测只要使肿瘤细胞表面失去GPI锚定, GPI锚定的CEACAM5 /CEACAM6能够与α5β1整合素受体结合，从而可能使肿瘤细胞失巢凋亡［7］。有研究发现只有与GPI 锚定的CEACAM5和CEACAM6才能与α5β1整合素受体结合发挥生物效应,失去GPI 锚定的可溶性的CEACAM5和CEACAM6则会失去与α5β1整合素受体结合的能力, 导致细胞存活信号从胞外向胞内的转导过程被阻断而引起凋亡［8］。用CEACAM5和CEACAM6稳定转染结肠肿瘤的两种细胞株SW112 和Caco-2发现,细胞表面表达的CEACAM5和CEACAM6分别增加10倍和30倍,并且在裸鼠过度表达CEACAM5和CEACAM6可促进其结肠肿瘤的形成。因此,GPI-PLD释放肿瘤细胞表面的CEACAM5和CEACAM6,使其失去与α5β1整合素受体结合的能力,因此，甲状腺癌细胞过度表达CEACAM5和CEACAM6等GPI锚定蛋白，从而促进了癌细胞的生长。
本研究结果还显示,GPI-PLD具有增强补体对肿瘤细胞的杀伤作用，可能是因为GPI-PLD基因表达增强,使细胞膜上GPI锚定的CD55和CD59等膜结合补体调节蛋白水解释放,从而使细胞失去CD55和CD59等的保护,导致肿瘤细胞失去对补体杀伤的抵抗作用, 从而增强肿瘤细胞对补体的敏感性而杀伤肿瘤细胞。
因此，稳定转染GPI-PLD 基因可以使细胞GPI-PLD 酶活性和GPI-PLD mRNA水平显著增高,GPI-PLD活性的改变影响了肿瘤细胞增殖、凋亡及对补体杀伤的敏感性,可以利用GPI-PLD 的水解活性来影响肿瘤细胞表面GPI锚定蛋白的释放从而达到治疗肿瘤的目的。
【参考文献】
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（编辑：齐 永）
作者单位：413001 湖南益阳，益阳市人民医院