诊断淀粉样变沉积的方法

【摘要】  淀粉样变（amyloid）是机体内一类沉积于组织、器官细胞间之内的无结构物质，经刚果红染色成红色，并且在偏振光显微镜下呈现绿色荧光，超微电镜观察淀粉样变为纤维状结构物质。临床诊断主要依靠刚果红染色结合偏振光诊断淀粉样变沉积。由于临床标本取材来源和患者需要，单纯依靠临床病理形态学诊断难以满足临床的需求。为了根据临床的具体要求，选择淀粉样的诊断方法和临床标本取材类型，了解淀粉样变诊断技术和方法，对于临床诊断淀粉样变，具有重要临床意义。

【关键词】  淀粉样变；诊断；刚果红；免疫组织化学

［Abstract］  The amyloidosis refers to a variety of conditions in which amyloid proteins are abnormally deposited in organs and/or tissues. In laboratory, amyloid can be diagnosed on microscopic examination of affected tissue. Also, amyloid deposits can be identified histologically by Congo red staining and viewing under polarized light where amyloid deposits produce a distinctive apple green birefringence. Other more specific tests are available to more precisely identify the amyloid protein by immunohistochemistry and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) method can used analysis gene mutation of amyliod precursor proteins. Biopsies are taken from affected organs or often in the case of systemic amyloid, from the rectum, skin, gingiva or omentum as anterior abdominal and adipose tissue.

    ［Key words］  amyloid; diagnosis; Congo red; immunohistochemistry

    1853年德国科学家Virchow 等在尸体解剖组织标本中，经病理染色（HE染色）发现染成紫红色，无定形结构沉积成分沉积于细胞间质的物质。大量研究表明，淀粉样变原因蛋白在外来因素作用下或蛋白自身发生结构变化后，形成蛋白纤维并沉积于细胞间质，导致组织细胞损害，引起器官功能低下、衰竭，而引起一系列综合临床症状。利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜结合免疫标记电子显微镜观察淀粉样蛋白纤维超微结构发现：淀粉样蛋白纤维是以serum amyloid protein (SAP)为中心，能够形成淀粉样蛋白纤维原因蛋白在外来因素、基因突变，原因蛋白内部β-sleated sheet 结构增加，多个β-sleated sheet部分重合形成微细蛋白纤维并以SAP为中心进一步形成纤维状结构。另外分析迄今为止能够形成淀粉样纤维的原因蛋白的超级结构，发现原因蛋白的二级结构中，与人体内其他非淀粉样沉积形成蛋白相比，蛋白二级结构中β-sleated sheet 结构含量明显增多。

    通过流行病学调查FAP、Amyloidosis A等类型淀粉样沉积的发病年龄随着年代的发展而提前，发现Antacipation现象表现在上述类型淀粉样沉积症中。淀粉样变沉积于脑实质及脑膜中小血管的疾病实体引起淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy,CAA）。CAA与自发性脑出血及缺血性脑损伤以及痴呆密切相关，已经引起社会的严重关注［1］。在我国2003年徐丹等研究中国老年人群不同年龄阶段组CAA在脑血管病中发生率为60～69岁22.1%,70～79岁26.7%, 80～89岁46.5%,90岁以上人群发病率已经达到66.7%［2］。流行病学调查结果发病率与德国、法国、美国、日本等发达国基本相似。国内外一个明确的结论是CAA发生率与年龄密切相关［3］。随着生活水平和医疗技术的进步，我国人均寿命逐年增加，CAA对我国人民生活水平造成的影响将日趋严重。 

    1  诊断方法

    1.1  组织病理诊断  刚果红染色结合偏振光法诊断组织内淀粉样变沉积，临床病理标本（尸解、手术、活检）标本，常规方法制备组织切片，经过脱石蜡和脱二甲苯，然后进行刚果红染色。

    刚果红染色，刚果红染色工作液染色60min，流水冲洗后，苏木苏溶液染色10min，氨水-乙醇溶液作用20s，脱水树胶封片，显微镜观察淀粉样变。

    偏振光观察，经过刚果红染色阳性标本，在偏振光显微镜下能够发出绿色荧光，具备刚果红和偏振光同时阳性条件，才能诊断为淀粉样变沉积。

    1.2  鉴别淀粉样变沉积蛋白类型  已经报道，迄今为止已经有25种不同类型蛋白能够形成淀粉样变沉积于组织［4,5]。人类不同疾患可以并发淀粉样变沉积，但是形成淀粉样变的蛋白纤维类型不同，例如FAP患者淀粉样变前蛋白为TTR蛋白［6］；DRA患者淀粉样变蛋白纤维前蛋白为 2-microglobulin蛋白［7］等。

    1.3  分子生物学技术分析淀粉样变前蛋白的基因或蛋白突变  淀粉样变前蛋白的基因突变与淀粉样变沉积形成密切相关，说明其机制的临床实例为家族性淀粉样变神经损害（FAP）患者，淀粉样变前蛋白为基因突变的TTR蛋白，而老年性淀粉样变（SSA）患者淀粉样变前蛋白为基因未发生突变型TTR蛋白。TTR蛋白基因型不同，淀粉样变沉积发生年龄明显提前，提示基因突变与促进淀粉样变的形成［8］。为分析淀粉样变前蛋白突变或前蛋白基因突变，对于病理形态学诊断淀粉样变，进一步分析淀粉样变沉积蛋白的突变具有意义，临床建议采用PCR-SSCP、MALDIL-TOF/MS方法。

    1.3.1  PCR-SSCP技术原理  PCR扩增的DNA片断过变形形成单链，然后快速复性，DND片断碱基，依靠分子之间的作用力形成互补集团，导致DNA片断形成一定的立体结构。如果基因发生点突变、基因插入、缺失以及相应变化，DNA片断的立体结构发生变化，在凝胶电泳时，由于DNA片断大小相同，所带电荷相同，但是分子立体结构不同，导致在凝胶内迁移率不同，在电泳时会发现基因突变的基因出现迁移率不同的DNA片断，能够达到鉴定基因突变的目的，大量研究报道，其灵敏度可以是一个碱基突变。

    1.3.2  MALDIL-TOF/MS技术原理  将物质分子标记上能量，经过激光照射，增加分子能量，在真空条件下，分子飞行到收集靶体上产生的偏差与分子质量密切相关，与标准对比能够精确计算物质分子的质量，能够判断淀粉样变蛋白的突变和化学修饰［9］。

    1.4  快速荧光诊断法  淀粉样变沉积超微结构分析，淀粉样变为纤维状结构，蛋白纤维结构蛋白分子形成的立体结构近似，探索能够与淀粉样变沉积结合的探针，建立荧光素标记化学探针方法，用于诊断淀粉样变沉积的方法［1］。该方法已经在临床医疗机构临床测试，该方法具有敏感、特异、快速的特点，适用于临床诊断淀粉样变达到快速诊断淀粉样变沉积的目的。

    1.5  同位素标记抗体影像诊断法  目前已经发现人体内有25种不同类型的蛋白能够形成淀粉样变，沉积于细胞间质，刚果红和偏振9庋粜浴８莸矸垩淝暗鞍卓乖灾票柑匾煨钥固澹固灞昙峭凰兀每乖?抗体特异性结合的特点，标记影像学的方法诊断淀粉样变沉积。但是，本方法具1傅娜?阌校海?）注射到体内的抗体能够与淀粉样变沉积结合，同时也能够与循环血液中的前蛋白结合，造成非特异性影像学改变。（2）形成淀粉样变的前蛋白具有多种类型，诊断淀粉样变需要禶种抗体，人机体内注射多种抗体能够导致产生过敏反应和增加患者负担。

    1.6  核磁共振诊断淀粉样变沉积  临床上，淀粉样变沉积的器官不同，诊断淀粉样变沉积的临床意义不同，脑血管岀血的淀粉样变沉积诊断具有重要意义。利用MRI可发现，脑血肿急性期T1WI呈等或低信号，T2WI呈低信号；亚急性期T1WI、T2WI呈低、高混合信号，分层状；慢性期T1MI呈高或低、T2WI呈高信号，从信号的特点可以辅助诊断淀粉样变，但是淀粉样变沉积程度与信号产生的关系有待予进一步研究［10～12］。

    2  总结

    随着医疗水平和人们寿命增加，淀粉样变沉积患者显著增多，早期诊断对于淀粉样变的治疗和预后直接相关。虽然对于淀粉样变诊断方法研究取得了飞速发展，有些方法难于适用临床，本论文建议临床诊断淀粉样变程序如图2所示。

【参考文献】
  1 刘金平,郑芳,冯强，等.荧光素标记靶体异性诊断淀粉样沉积的方法研究.中国医学检验杂志,2008,9（5）：244-246.

2 殷小平，张苏明，郑美蓉，等.血管淀粉样变相关脑出血的初步研究.中华医学杂志,2005,85(２)：120-121.

3 许丹，杨春慧，王鲁宁.老年人脑淀粉样血管病的临床及病理研究.中华内科杂志,2003,42（8）:541-544.

4 Song F, Poljak A, Smythe GA, et al. Plasma biomarkers for Mild Cognitive Impairment and Alzheimer's disease. Brain Res Rev, 2009,20.

5 Uversky VN, Fink AL. Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded. Biochim BioHpys Acta. 2004,1698(2):131-153.

6 刘金平,崔秀凤,郑芳,等.家族性淀粉样多发性神经损害患者淀粉样沉积内存有脂蛋白.临床和实验医学杂志,2009,8(4):8-10.

7 赵辉,刘金平,郑芳,等.肾功能衰竭透析并发淀粉样沉积内存脂蛋白.第四军医大学学报,2008,29（5）431-433.

8 Sun X, Ueda M, Yamashita T, et al. Lipid droplets are present in amyloid deposits in familial amyloidotic polyneuropathy. Amyloid,2006,13：20-23.

9 赵辉,刘金平,郑芳.分析家族性淀粉样多发性神经性损害转甲状腺蛋白的化学修饰.第四军医大学学报,2008,29（10）：883-885.

10 方向军,谭理连,肖平，等.脑血管淀粉样变性相关脑出血的临床特点与MRI表现.实用医学杂志,2007,23（7）：213-215.

11 Jack CR JR, Lowe VJ, Weigand SD, et al.Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative Serial PIB and MRI in normal, mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease：implications for sequence of pathological events in Alzheimer's disease. Brain, 2009,132：1355-1365.

12 Meadowcroft MD, Connor JR, Smith MB, et al. MRI and histological analysis of beta-amyloid plaques in both human Alzheimer's disease and APP/PS1 transgenic mice. J Magn Reson Imaging, 2009,29(5):997-1007.

(编辑：余 强)

作者单位：天津市自然基金资助（课题号：07JCYB15700） 300203 天津，天津医科大学医学检验系