点击显示 收起
【摘要】 目的 提高甲真菌病诊断的准确率和阳性率，探索新的实验方法。方法 对疑为甲真菌病感染者61例采用20%KOH溶甲法从甲标本中检测真菌，并与直接镜检法、真菌培养法和组织病理学检查进行比较。结果 20%KOH溶甲法检出率86.89%，高于直接镜检法、真菌培养法和组织病理学检查。结论 20%KOH溶甲法是一种检出率高、可行性强的甲真菌病诊断方法。
【关键词】 甲真菌病；诊断
Diagnosis of onychomycosis with 20% KOH-treated nail clippings-comparison with direct microscopic examination, fungal culture, histopathologic examination
LI Wei, RAN Yu-ping, DU Xiao-ping,et al.
Department of Dermatovenereology, Huaxi Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
【Abstract】 Objective To improve the rate of accuracy and positiveness in diagnosis of onychomycosis, and to explore new approaches.Methods 61cases of suspected onychomycosis were tested by KOH-treated nail clippings, and compared with direct microscopic examination, fungal culture, histopathologic examination. Results The positive rate of KOH-treated nail clippings was 86.89%, and was also higher than other approaches.Conclusion KOH-treated nail clippings is a reliable method that has proved high positive rate.
【Key words】 onychomycosis；diagnosis
甲真菌病在自然人群中的发病率为2%~13%［1］，与其他皮肤病如银屑病等从临床上难以区别，甲屑直接镜检和真菌培养是公认诊断甲真菌病的金标准，但受取材的质和量等因素影响，二者结合诊断的阳性率＜70%［2］。近年来开展了剪取病甲做组织病理学检查［3］，使查菌的阳性率得以提高，却存在着制作繁杂、耗时长等缺点，限制了其推广。为了寻求检出率高、可行性强的诊断方法，我们采用20%KOH溶甲法（以下简称溶甲法）从甲标本中检测真菌，并与直接镜检法、真菌培养法（以下简称培养法）和组织病理学检查（以下简称病检法）进行了比较。
1 资料与方法
1.1 一般资料 我科门诊和住院疑为甲真菌病感染者共61例，男24例，女37例，年龄8~70岁，平均34.5岁，病程3个月~40年，平均7.2年。指、趾甲共207个。均在受检前1个月内未接受过局部和系统抗真菌药物治疗。
1.2 标本采集 以75%酒精消毒病甲表面后，用消毒手术刀刮弃表层甲屑，刮和剪取足量甲（屑），分为4份。
1.3 方法和判断标准 4份标本分别按下述4种方法处理。
1.3.1 直接镜检法 取刮下甲屑于载玻片上，加10%KOH 1滴溶解，10min后观察，镜下见菌丝和(或)孢子者为阳性。
1.3.2 培养法 甲（屑）分别接种于以下3种培养基：(1)含氯霉素、放线菌酮的沙堡培养基，25℃~28°C培养；(2)含氯霉素、不含放线菌酮的沙堡培养基，25℃~28°C培养；(3)含菜籽油的沙堡培养基，37°C培养。每管培养基种2~4点，培养4周无菌落生长为阴性；有菌落生长者，据其生长特征以及玻片法或钢圈法培养结构特点做菌种鉴定，必要时做米粉吐温琼脂培养基、尿素酶培养基帮助鉴定。
1.3.3 病检法 (1)剪下的病甲经2.5%戊二醛固定；(2)软化脱钙（脱钙液：盐酸34ml、氯化铝28g、甲酸20ml，蒸馏水400ml）；(3)酒精梯度脱水及氯仿处理（酒精浓度分别为85%、95%、100%）；(4)石蜡包埋、切片；(5)染色、封片镜检（行PAS及六胺银染色）。组织中见到菌丝和(或)孢子者为阳性。
1.3.4 溶甲法 (1)病甲置20%KOH内，56°C水溶30min；(2)生理盐水洗涤溶解物，离心后弃上清液；(3)沉淀物涂片；(4)丙酮固定；(5)Parker墨水染色，封片镜检。观察到菌丝和(或)孢子者为阳性。
2 结果
2.1 直接镜检法 61例拟诊患者甲标本中，真菌阳性者35例（57.38%），见图1。
2.2 培养法 61例拟诊患者甲标本培养出38例40株真菌，单一感染36例（94.74%），混合感染2例（5.26%）。菌种分布情况：33株皮肤癣菌中红色毛癣菌31株，须癣毛癣菌2株，见图2；酵母菌6株中白色念珠菌2株，糠秕马拉色菌3株，念珠地丝菌1株；曲霉属1株。有2例为混合真菌感染，1例为红色毛癣和糠秕马拉色菌，1例为红色毛癣菌和白色念珠菌。
2.3 病检法 46例检出真菌成分。35例直接镜检阳性标本中，34例检出真菌成分。33例有皮肤癣菌感染病甲的菌丝多较细，分隔、分支，可见链状关节孢子，常位于裂隙中，见图3；4例分离出酵母菌病甲的孢子小、散在或群集。1例分离出真菌病甲的菌丝粗而短，着色不均，排列紊乱，多位于裂隙中。9例培养阴性病甲的甲板中均见有真菌成分，菌丝较细，分隔，菌体多侵犯甲板深层，平行、斜行或垂直于甲板表面走行，提示为皮肤癣菌。3例培养阴性的病甲：2例银屑病患者疑合并甲真菌感染标本和1例疑甲真菌感染标本（随访3个月后出现银屑病束状发），见角化不全，大量细胞核残留，无菌丝和孢子，提示为银屑病甲改变，可排除甲真菌病的诊断。
2.4 溶甲法 35例直接镜检阳性标本均检出真菌成分。33例皮肤癣感染的病甲：菌丝多较细，见图4；2例分离酵母菌的病甲，1例见假菌丝和顶端厚壁孢子，提示为白色念珠菌。17例培养阴性的病甲：菌丝多较细，分隔、分支，关节孢子，提示多为皮肤癣菌。
2.5 4种方法检出结果 见表1。
表1 61例疑甲真菌病4种方法检查结果 (略)
病检法与直接镜检相比，χ2 =7.69，P<0.05，病检法检出率高于直接镜检法；病检法与培养法相比，χ2 =4.9，P<0.05，病检法检出率高于培养法；溶甲法与直接镜检相比，χ2 =16.06，P<0.05，溶甲法检出率高于直接镜检法；溶甲法与培养法相比，χ2=10.32，P<0.05，溶甲法检出率高于培养法；溶甲法与病检法相比，χ2=4.0，P<0.05，溶甲法检出率高于病检法。
3 讨论
甲真菌病是为数不多的可治疗的甲病之一，因而其正确诊断十分重要。直接镜检检出率较低，本研究为57.38%，但快速、方便，可直接明确有无真菌感染。培养法检出率62.30%，造成培养阳性率低的原因可能是：(1)取材不当，如标本中无活的菌丝存在，取甲屑培养则无菌生长。(2)培养基选择，如放线菌酮在一定程度上抑制皮肤癣菌以外的真菌（酵母菌）生长。培养法要求观察4周，门诊一般也要10天后出报告，耗时虽较长，但可鉴定菌种，进而行药敏试验，对药物的选择有一定指导意义，如克柔念珠菌对氟康唑天然耐药。
病检法检出率75.41%，高于直接镜检和培养法，能观察到真菌在甲中寄生的状况，可对病原菌做初步分类，并可对银屑病等病甲明确诊断，但由于病理切片只能观察甲的断面，相对容易漏诊和误诊，甲切片对切片刀磨损大，制片过程需1周，对实验人员实验组织病理学要求较高，使该法推广受限。
溶甲法检出率86.89%，高于直接镜检、培养法和病检法。溶甲法通过较高浓度KOH和加热溶解角质，在短时间内将寄生于甲内的真菌充分暴露，洗去甲溶解物质，可使整个病甲而非某一断面的真菌沉淀涂片观察，从而使甲真菌病的检出率大为提高。Liu等于1993年开展了20%KOH处理甲屑后PAS染色诊断甲真菌病［4］，国内甄莉等有类似报道［5］。我们考虑到PAS染色过程需反复冲洗，相对复杂，同时增加了样本损失的可能性，故改用Parker墨水染色。该法能清晰地观察到各种形态的菌丝和孢子，真实地反映了真菌在组织内的寄生形态，从而较全面地辨析病原菌类别；菌丝量多少与甲受累轻重程度相一致，如菌丝少而散在者甲变色变形程度轻，大量菌丝扭曲成团者甲变色变形明显。除典型假菌丝和顶端厚壁孢子提示白色念珠菌感染，曲霉头、帚状枝结构可提示曲霉和青霉感染外，溶甲法不能进行真菌种类的鉴定。
溶甲法在甲真菌病诊断方法中具有准确、快速、简便、价廉及可保存等特点。门诊病例可无需固定步骤，制作湿片即可镜下观察出报告，完成1份标本在1h左右，在日益繁忙的皮肤性病科门诊具有推广价值。
通过对甲真菌病4种诊断方法的对照研究表明：20%KOH溶甲法是一种检出率高、可行性强的甲真菌病诊断方法。结果提示组织病理学检查和20%KOH溶甲法可弥补甲真菌病诊断真菌直接镜检和真菌培养法的不足，显著提高诊断阳性率和准确率。
(本文图片略)
【参考文献】
1 Roberts DT.Prevalence of dermatophyte onychomycosis in the united Kingdom: results of
an omnibus survey. Br J Dermatol, 1992，126(S39):23-27.
2 Daniel CR.The diagnosis of nail fungal infection. Arch Dermatol,1991，127:1566-1567.
3 牛云彤,李少平.甲真菌病的诊断.中国麻风皮肤病杂志, 2004，20(1): 57-58.
4 Liu HN.KOHCPA: a new method for diagnosing tinea unguium. Dermato, 1993，187:166-168.
5 甄莉, 刘亚军.不同浓度NaOH溶解疑甲癣病甲检测真菌41例. 山西医科大学学报, 2000，
31(1):81.
作者单位： 610041 四川成都，四川大学华西医院皮肤性病科
(编辑：吴 莹)