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【摘要】 目的 研究人胆囊癌组织中MMP-1，MMP-9以及TIMP-2的表达水平及与MVD的关系，探讨它们之间的相互关系及与胆囊癌临床病理特征的意义。方法 用ABC免疫组化法测定31例胆囊癌组织及10例慢性胆囊炎组织石蜡切片标本中MMP-1，MMP-9以及TIMP-2，MVD计数。结果 （1）31例胆囊癌组织中MMP-1，MMP-9的阳性表达率及其评分和MVD计数均值（以CD34阳性计数）分别为16例（51.6%）和20例（64.5%），明显高于10例慢性胆囊炎组织1例（10.0%）和2例（20.0%），差异有非常显著性（P<0.01）;胆囊癌组织中TIMP-2的阳性表达13例41.9%）则低于慢性胆囊炎组织9例（90.0%），差异有非常显著性（P<0.01）。（2）MMP-1，MMP-9以及TIMP-2，MVD在胆囊癌组织的表达情况与胆囊癌的临床病理分化程度、肿瘤有无转移有明显相关（P<0.01）。（3）在胆囊癌组织中MMP-1，MMP-9与MVD计数之间存在TIMP-2与MVD计数之间存在着正相关（MMP-1vs MVD，r=0.658，P<0.01，MMP-9vs MVD，r=0.391，P<0.05），TIMP-2与MVD计数之间存在着负相关（r=-0.542，P<0.01）。结论 （1）MMP-1，MMP-9的表达与胆囊癌的发生、发展可能关系密切;（2）二者可能具有促进肿瘤血管生成的活性;（3）TIMP-2则可能通过抑制肿瘤血管生成而抑制肿瘤的发生、发展。
Liu Xiangfeng，Wang Xintian，Wu Jinshu，et al.
Department of Hepatobiliary Surgery，Hunan People’s Hospital，Changsha410002.
【Abstract】 Objective To investigate the expression ofMMP-1，MMP-9，TIMP-2and its relations withMVD in gallbladder neoplasm tissues of human，then explore their relationship and clinicopathological significance of gallbladder neoplasm.Methods Immunohistochemical method of ABC was used for the MMP-1，MMP-9，TIMP-2and MVD on the rountinely paraffin-embedded sections of31specimen of gallbladder neoplasm tissues and10specimen of chronic cholecystitis.Results （1）The positive rates or the scorings of MMP-1，MMP-9and MVD were significantly higher in human gallbladder neoplasm than that in human chronic cholecystitis（P<0.01），But the positive rates of MMP-2in human gallbladder neoplasm were significantly lower than that in human chronic gallbladder cholecystitis（P<0.01）.（2）The closely positive correlations were found among the expressive scorings ofMMP-1，MMP-9，TIMP-2，MVD and the clinicopathological type，differentiated degree，with or without metastasic tumor.（3）The closely positive correlations were found among the expressive scoring of MMP-9and MVD，but the negative correlations existed among the expressive scoring of TIMP-2and MVD.Conclusion （1）The expressions ofMMP-1，MMP-9，MVD may be important elements reflecting carcinogenesis，progression，biological behaviors of gallbladder carcinoma.（2）MMP-1，MMP-9may be closeˉly related to enhance neovascularization of the gallbladder neoplasm;（3）TIMP-2might inhibit the pathogenesis and growth of gallbladder neoplasm by inhibiting tumor angiogenesis.
Key words gallbladder neoplasm immunohistochemistry matrix metalloproteinases microvessel density
胆囊癌是生物学恶性程度较强的消化道肿瘤，易于早期浸润、转移，预后差 ［1］ ，而血管生成是使肿瘤生长、浸润和转移的基础。肿瘤的血管生成是指从业已存在的血管网上生长出新生血管，它包括:内皮细胞的激活、增殖;原有血管基底膜及细胞外基质降解、破坏;内皮细胞的迁移、吻合。近年来学者们广泛的研究了MVD与恶性肿瘤转移和预后的关系，认为MVD是反映肿瘤血管生成活性或强度的重要指标 ［2］ 。在血管生成的过程中，ECM、BM的降解不仅可促进内皮细胞的移动，有利于血管生成，而且还有利于肿瘤细胞脱落，进入血管或邻近组织，为肿瘤的浸润、转移创造条件。基质金属蛋白酶（Matrix Metalloˉproteinase，MMPs）是降解ECM和BM的一种重要蛋白水解酶，其中以MMP-1，MMP-9最为重要 ［3］ ，而TIMP（Tissue linhibitor of Matrix Metallopoteinase，TIMPs）为MMPs的天然抑制剂，可使之失活，抑制其对ECM、BM的降解，从而抑制血管生成 ［4］ 。
有关胆囊癌组织中MMP-1，MMP-9，TIMP-2与MVD的关系及与胆囊癌临床病理特征之间的关系，国内外尚未见文献报道。本研究运用免疫组织化学的方法对31例胆囊癌手术标本石蜡切片中的MMP-1，MMP-9，TIMP-2及CD34的表达情况进行检测，探讨它们与胆囊癌临床病理特征之间的关系，为研究胆囊癌血管生成与浸润、转移提供一定的理论依据，为胆囊癌的治疗提供新的治疗途径。
1 材料与方法
1.1 标本收集 收集湖南省人民医院肝胆外科近10年胆囊腺癌手术切除标本31例，男9例，女22例，年龄范围32～78岁，平均49±17岁，均为胆囊癌，包括高分化腺癌7例，中分化腺癌10例和低分化腺癌14例;临床和（或）病理证实发生胆囊外转移（包括区域淋巴结、网膜、邻近组织器官等）24例（77.4%）。另收集慢性胆囊炎手术切除标本10例，男4例，女6例，年龄范围35～65岁，平均45±10岁。上述标本经10%福尔马林固定后，常规制作石蜡包埋连续切片，切片厚4μm。
1.2 试剂 兔抗人相关抗原，生物素标记羊抗兔ABC试剂，DAB-HCL显色试剂盒，TIMP-2、MMP-1、MMP-9、CD34试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.3 方法
1.3.1 MMP-1，MMP-9，TIMP-2，CD34染色方法 四个指标染色的方法均为SABC免疫组化法，具体步骤如下:切片常规脱蜡至水，蒸馏水新鲜配置3%H 2 O 2 ，室温5～10min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），电炉或微波炉加热至沸腾后断电间隔5～10min后，反复1～2次。冷却后0.1M PBS洗涤1～2次。抗原修复液Ⅰ进一步暴露抗原，滴加在切片上室温5 ～10min后，0.1M PBS洗涤2～3次。滴加正常山羊血清封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗。滴加适当稀释的-抗（兔IgG），4℃过夜。0.1M PBS洗2min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG，20℃～37℃20min。0.1M PBS洗2min×3次。滴加试剂SABC，20℃～37℃20min。0.1MPBS洗5min×4次。DAB显色:使用DAB显色试剂盒（AR1022）。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片。5min后蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染。脱水，透明，中性树胶封片。显微镜观察。
1.3.2 TIMP-2、MMP-1、MMP-9表达的评分 TIMP-2、MMP-1、MMP-9表达的判断:细胞浆中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。MMP-1、MMP-9、TIMP-2表达的评分方法:将癌细胞SAB着色强度评分（0分，无;1分，弱;2分，中;3分，强）和阳性细胞率评分（0分，<5%;1分，5%～10%;2分，11%～20%;3分，21%～50%;4分，>50%）之和为该病例评分值，且将评分值0～2分定为阴性表达病例，>2分定为阳性表达病例 ［5］ 。
1.4 MV计数 MV的判断（CD34标记）:任何被染成棕黄色孤立的内皮细胞与邻近微血管、肿瘤细胞之间存在明显分离的内皮细胞团，均按独立的微血管分别记数，是否有血管腔不作为记数微血管的必要条件，分支血管结构只要不相连也视为另一个微血管，但血管大于8个红细胞面积或血管周围有平滑肌包绕的较大血管不纳入记数范围。其免疫组化阳性颗粒呈黄棕色至深黄棕色，在癌和间质组织内均有分布。MV计数方法，先在低倍镜下选择切片中癌灶浸润最明显且间质微血管最为丰富处，然后在200倍镜下进行记数，记数5个视野中染成玫瑰红的微血管数目，取平均值作为微血管密度记数 ［6］ 。
1.5 统计方法 将所得数据输入SPSS10.0软件包进行t检验、χ 2 检验及非参数Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05和α=0.01。
2 结果
2.1 人胆囊癌TIMP-2、MMP-1、MMP-9的表达 详见表1。
表1 TIMP-2，MMP-1，MMP-9在胆囊癌组织与慢性胆囊炎组织中表达的关系 略
31例胆囊癌TIMP-2、MMP-1、MMP-9表达阳性病例分别为13例（41.9%）、16例（51.6%）和20例（64.5%），10例慢性胰腺炎TIMP-2、MMP-1、MMP-9表达阳性病例分别为9例（90.0%）、1例（10.0%）和2例（20.0%），胆囊癌组织中MMP-1、MMP-9阳性表达率及其评分均明显高于慢性胆囊炎组织，差异有非常显著性（P<0.01）。而胆囊癌组织中TIMP-2阳性表达率及其评分明显低于慢性胆囊炎组织，差异有显著性（P<0.01）。
2.2 人胆囊癌TIMP-2、MMP-1、MMP-9的表达与胆囊癌分化程度和转移的关系 高、中分化腺癌和无转移癌MMP-1、MMP-9阳性表达率及其评分低于低分化腺癌和有转移癌，除MMP-1评分值差异有显著性外（P<0.05），其余差异均有非常显著性（P<0.01）。而高分化腺癌和无转移癌TIMP-2阳性表达率及其评分明显高于低分化腺
癌和有转移癌，差异有非常显著性（P<0.01）。详见表2。
表2 TIMP-2、MMP-1、MMP-9的表达与胆囊癌分化程度和转移的关系略
2.3 MV计数
2.3.1 人胆囊癌病例MV计数 31例胆囊癌组织MVD均值为（57.89±8.44）个/HP，慢性胆囊炎组织MVD均值为（20.04±5.92）个/HP。胆囊癌组织MVD均值明显高于慢性胆囊炎组织MVD均值，差异有非常显著性（P<0.01）。
2.3.2 人胆囊癌TIMP-2、MMP-1、MMP-9的表达与MVD计数的关系 详见表3。
表3 TIMP-2，MMP-1，MMP-9的表达阳性率与MVD的关系略
MMP-1、MMP-9的表达阳性病例MVD明显高于阴性病例，差异有非常显著性（P<0.01）;而TIMP-2的表达阳性病例MVD明显低于阴性病例，差异有非常显著性（P<0.01）。经相关分析发现MMP-1评分值与MVD（r=0.767，P<0.01），MMP-9评分值与MVD（r=0.660，P<0.01）之间存在高度密切正相关;TIMP-2评分值与MVD（r=-0.542，P<0.01）之间存在高度密切负相关。同时相关分析发现TIMP-2评分值与MMP-1（r=-0. 475，P<0.01），MMP-9（r=-0.532，P<0.01）评分值之间存在高度密切负相关。
3 讨论
胆囊癌的生长和转移是一个多步骤、多因素的复杂过程。其中血管生成起着重要的作用，为肿瘤的发生、发展提供了营养，同时大量的新生血管增加了肿瘤细胞进入循环的机会。当肿瘤体积<1mm 3 时，这一过程可通过组织渗透来完成;当体积>2mm 3 时，肿瘤的发展必须依赖新生血管的生成，此时肿瘤的向外浸润生长的过程中，血管生成是同步进行的 ［7］ 。
本研究表明:胆囊癌组织中MVD较正常组织明显增加，且高MVD表达与胆囊癌的分化程度呈正相关（P<0.01）;有远处转移者大于无远处转移者（P<0.01）。同时还发现胆囊癌组织中微血管不仅数量增加，而且其形态和结构也存在明显缺陷，病理学检查发现肿瘤微血管多为幼稚新生血管，血管基底膜变薄或消失呈裂隙状。这些新生成的大量幼稚血管结构缺乏完整性，增加了肿瘤细胞进入循环达到远处器官的概率。因此胆囊癌细胞容易渗透有缺陷的微血管而发生转移，这些均提示MVD可反映胆囊癌的进展。这与文献报道的一致 ［6］ 。高MVD表达的肿瘤易发生转移并与肿瘤的恶性程度及预后相关。
目前常用的血管标志物有CD34抗原、血管因子Ⅷ抗原、CD31抗原，其中CD34因特异性定位、背景清晰、易计数的优点而常选择其为检测MVD的标志物 ［9］ 。它具有粘附、加速血管内皮细胞聚集形成血管，调控造血细胞的增生和分化的功能。可用来测量肿瘤内及缺血组织微血管的密度（MVD）和面积，检测早期的新生微血管形成。
本研究CD34的阳性表达率随着肿瘤分化程度降低而增加，强度增大。这些均提示CD34阳性表达率及其强度与胆囊癌的良恶性有显著相关（P<0.01），CD34阳性表达评分与肿瘤的转移呈正相关。提示CD34高表达区域是肿瘤血管生成的活跃区域，与肿瘤的浸润和转移有关。
ECM和BM是主要由Ⅳ型胶原等成分构成，为一致密的网状结构，固有细胞不能通过，是阻止肿瘤细胞浸润、转移的天然屏障。MMPs能有效地降解ECM，BM的成分，这对于血管生成所必须的内皮细胞迁移及肿瘤发生浸润、转移极为重要 ［10］ 。肿瘤细胞除自身分泌MMPs外，还通过分泌促血管生成因子，间接促进血管内皮细胞产生MMPs。Fang ［11］ 等实验研究证明MMPs在肿瘤血管生成中有重要作用而ECM和BM的降解对血管生成所必须的内皮细胞迁移极为重要。它们能够降解微静脉周围的基膜，使内皮细胞得以脱离母静脉而迁移至血管周围的基质中，进而毛细血管出芽、管腔形成。所以MMPs被认为是肿瘤血管生成关键因素之一。其中MMP-1，MMP-9是降解Ⅰ、Ⅳ型胶原从而破坏ECM、BM完整性的重要酶。
然而，MMP-1、MMP-9在肿瘤血管生成中的作用有所不同。MMP-1的表达分布主要在间质细胞（成纤维细胞等），巨噬细胞中。以降解Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，又称间质胶原酶。它是第一个被定性的MMPs，它可降解间质胶原（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅶ型胶原、明胶等），它首先降解胶原稳定、致密的三股螺旋结构，使之断裂成胶原片段，MMP-9才能进一步分解胶原片段，MMP-1是启动胶原降解的酶 ［12］ 。MMP-9是这一家族中的又一重要成员，又名明胶酶B，原型分子量为92KD，活化后分子量为82KD。其底物主要为明胶，Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维等。其中，Ⅳ型胶原为基底膜的主要构成成分，在肿瘤中，肿瘤细胞可分泌大量的明胶酶（MMP-9），使其与其抑制剂失衡，从而破坏上皮、血管基底膜，使肿瘤细胞发生浸润和转移。Riedel等 ［13］ 报道，MMP-9可作为肿瘤血管生成的调控因素参与肿瘤血管生成，并且MMP-9与VEGF在肿瘤血管生成中起协同作用。本研究提示MMP-1、MMP-9不仅在癌细胞中 表达，而且基质中的纤维母细胞、单核吞噬细胞中也有表达，其阳性表达强度以浸润癌巢周围最明显，同时其MVD的表达亦明显升高，MMP-1、MMP-9阳性表达MVD显著大于MMP-1、MMP-9阴性表达者（P<0.01），而MMP-1、MMP-9表达与胆囊癌分化程度相关。这一结果表现出MMPs表达与MVD的表达相一致，提示MMPs的高表达可能与诱导胆囊癌血管生成有密切关系。在MMP-1、MMP-9阳性表达的肿瘤中，阳性细胞主要位于癌巢与间质的交界处，而在肿瘤内部表达不明显，这可能说明MMP-1、MMP-9的表达不仅受肿瘤细胞自身的作用，同时也受到环境的调节，其中肿瘤细胞与间质之间的相互作用对肿瘤的高表达具有重要的作用。MMP-1、MMP-9的表达与肿瘤的分化程度密切相关（P<0.01）表明MMP-1、MMP-9的表达不仅反映了肿瘤破坏基质的能力，同时也预示着肿瘤的恶性程度，即高表达MMP-1、MMP-9的肿瘤细胞较不表达或低表达的肿瘤具有更高的浸润性和较高的异形性这说明它们与肿瘤的浸润密切相关，和其他一些学者观察到的结果一致 ［14］ 。
MMPs活性组织抑制物TIMPs广泛存在于许多组织中。目前发现有4种TIMPs，仅有TIMP-1、TIMP-2与活性MMPs以1∶1（摩尔比）结合形成复合体，从而抑制MMPs的活性。TIMP-2对MMP-2、MMP-9前MMP-2均显示出较强的抑制活性。TIMP-2是相对分子质量为21×103的非糖基化蛋白质，是MMP-9、MMP-2的天然抑制剂，TIMP-2通过与MMP-9以及MMP-2的酶原分子的羧基端形成一种分泌络合物，从而抑制其活性从而抑制MMPs的产生及其活性，从而抑制了肿瘤的血管生成及肿瘤的浸润和转移。而肿瘤组织中TIMP-2与MMP-9之间的平衡被破坏，从而局部ECM降解、内皮细胞迁移、新生血管生成 ［15］ 。
本研究表明，MMP-1、MMP-9和TIMP-2不仅在胆囊癌组织中呈阳性表达，尤其是在癌巢周边和浸润活跃处表达细胞较多，MMP-1、MMP-9表达随着胆囊癌分化程度增高而有增高趋势，而TIMP-2的阳性表达情况则随着胆囊癌分化程度增高而有下降趋势。MMP-1、MMP-9在低分化胆囊癌的阳性表达率显著高于高分化胆囊癌，P<0.01;TIMP-2在低分化胆囊癌的阳性表达率显著低于高分化胆囊癌，P<0.01。这提示MMP-1、MMP-9和TIMP-2调节失衡在胆囊癌恶变与转移过程中起重要作用。分析MMP-1、MMP-9和TIMP-2的表达与MVD的关系发现，MMP-1、MMP-9阳性表达的癌组织中MVD评分值显著高于MMP-1、MMP-9阳性表达肿瘤组织中的MVD，而TIMP-2则与之相反，P<0.01。提示MMP-1、MMP-9对肿瘤新血管的生成可能起促进作用，而TIMP-2则起阻抑作用。上述结果表明MMP-1、MMP-9和TIMP-2可能均参与了胆囊癌的新血管生成的调节。MMP-1、MMP-9和TIMP-2表达失衡促进肿瘤的侵袭和转移。
4 结论
（1）MMP-1，MMP-9的表达与胆囊癌的发生、发展可能关系密切。（2）MMP-1、MMP-9可能具有促进肿瘤血管生成的活性。（3）TIMP-2则可能通过抑制MMP-1，MMP-9的活性及肿瘤血管生成而抑制肿瘤的发生、发展。
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作者单位:1 410002湖南省人民医院肝胆外科
2 410002中南大学湘雅二医院肝胆外科
（收稿日期:2004-07-07） （编辑莉 莉）