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【摘要】 目的 利用假狂犬病毒跨突触示踪技术，研究胸髓横断伤所致的急、慢性脊髓损伤（SCI）对膀胱脊髓神经支配通路的影响。方法 76只SD大鼠随机分为4组:non-SCI、SCI a 、SCI b 和SCI c 组。SCI a 、SCI b 和SCI c 组大鼠完全横断脊髓，在饲养不同时间后，膀胱壁内注射假狂犬病毒（PRV）;non-SCI组大鼠不损伤脊髓，仅于膀胱壁组织内注射PRV。各组注射PRV后于既定时间点经心脏灌注固定取材。采用链霉卵白素—过氧化物酶（SP）免疫组织化学方法显示背根神经节（DRG）和脊髓切片中PRV阳性神经元。计算机图像分析软件统计各组PRV阳性神经元数目和面积，单因素方差分析比较各组统计值差异。结果 non-SCI、SCI a 、SCI b 和SCI c 组大鼠膀胱重量分别为（144±9）mg、（142±8）mg、（486±51）mg和（656±69）mg。non-SCI和SCI大鼠PRV示踪的时限性和分布相似。SCI大鼠病毒标记的DRG细胞面积显著增加（P<0.001），non-SCI、SCI a 、SCI b 和SCI c 组分别为（593±40）μm 2 、（588±39）μm 2 、（815±53）μm 2 和（902±57）μm 2 。慢性SCI大鼠在注射PRV后第3天，L 6 和S 1 节段后角标记细胞数显著增加;注射后第4天，L6 和S 1 节段标记的运动神经元数也显著增加。结论 急性和慢性脊髓损伤不影响大鼠膀胱的PRV示踪特性。慢性SCI大鼠膀胱排尿反射通路出现显著重组。
关键词 脊髓损伤 膀胱 排尿反射通路 假狂犬病毒 跨突触示踪
Effect of thoracic cord transection on the urinary bladder spinal neural pathway in rats:a transsynaptic tracing study by PRV
Yu Xing，Xu Lin
Orthopedics Centre，Dong zhimen Hospital，Beijing University of TCM，Beijing100700
【Abstract】 Objective To determinate the effect of acute and chronic spinal cord injury（SCl）resulted from thoracic cord transection on the urinary bladder spinal neural pathway with a transsynaptic tracing study using Pseuˉdorabies Virus（PRV）.Methods 76adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into4groups，non-SCI，SCI a ，SCI b and SCI c respectively.The non-SCI rats underwent no surgical procedure except pseudorabies vires（PRV）tracer injection into the bladder tissue while the rats of other groups were spinalized and given PRV injection at differˉent time after SCI.Transcardiac perfusion fixation was done in appropriate survival periods after PRV injection.Then sections of dorsal root ganglion（DRG）and spinal cord were processed for visualization of virus by the Streptavidin-Peroxidase（SP）immuno-histochemical procedure.All sections were measured with the Olympus Cue-2image analˉysis system.One way analysis of Variance test was used for comparison of different measurements between normal and spinalized rats.Results The bladder weights in non-SCI，SCI a ，SCI b and SCI c rats were（l44±9）mg，（142±8）mg，（486±51）mg and（656±69）mg respectively.The time-ordered flow charts of PRV tracingwere similar in the non-SCI rats and in the SCI rats.The cross-sectional area of the labeled DRG cell profiles increased significantly after SCI（P<0.001），which were（593±40）μm 2 ，（588±39）μm 2 ，（815±53）μm 2 and（902±57）μm 2 in non-SCI，SCI a ，SCI b and SCI c rats respectively.The number of labelled cells in dorsal horn in L 6 and S l segments3days after PRV injection markedly increased in chronic SCI rats and so did the number of labeled motor neurons4days post-inˉjection.Conclusion The acute and chronic SCI has no effect on the process of virus transsynaptic transport belowthe level of lesion Subsequent to chronic SCI marked reorganization of the micturition reflex pathways occurs.
Key words spinal cord injury bladder micturition reflex pathways pseudorabies virus transsynaptic tracˉing
下尿道（LUT）具有贮尿和周期性排尿两个重要功能，这些功能需要在中枢神经系统调控下，通过膀胱逼尿肌和尿道外括约肌来协调完成。腰骶副交感神经核近端的脊髓损伤（SCI）破坏了自主排尿和脊上中枢对排尿的控制，急性期后出现由脊髓反射通路调节的自发性排尿、膀胱过度活跃伴随尿道括约肌的张力性活动（逼尿肌-括约肌失调DSD） ［1］ 。临床和电生理研究证实，SCI后膀胱过度活跃与无髓C-纤维膀胱传入通路表型改变以及协调膀胱和括约肌功能的排尿反射通路重组关系密切 ［2，3］ 。然而目前相关的神经解剖研究报道很少［4］ 。Strack等 ［5］ 首次证实假狂犬病毒（PRV）的Bartha株可作为神经解剖研究的特异的跨突触示踪剂以来，这项技术已应用于肾脏 ［6］ 、膀胱 ［7］ 和尿道 ［8］ 等多个器官的中枢自主神经通路研究。尽管国外已有应用此技术研究正常大鼠的脊髓和脑神经支配的报道 ［7，9］ ，但尚无用于SCI后大鼠膀胱神经支配的研究报道。本研究的目的是利用PRV逆行性跨突触示踪技术研究急性和慢性SCI对膀胱脊髓神经通路的影响，着重比较正常大鼠和SCI大鼠膀胱神经支配的脊髓环路的差异，现将研究内容报告如下。
1 材料与方法
1.1 分组 76只成年SD大鼠（230～280g）随机分为4组:N组（n=18）:仅进行膀胱壁PRV注射的正常大鼠，称non-SCI大鼠:A组（n=15）:胸髓横断后即刻膀胱壁注射PRV，称SCI a 大鼠;B组（n=19）:胸髓横断后3周膀胱壁注射PRV，称SCI b 大鼠;C组（n=24）:胸髓横断后3个月膀胱壁注射PRV，称SCI c 大鼠。
1.2 方法
1.2.1 麻醉 在氯氨酮/赛拉嗪腹腔麻醉下（75mg/kg和5mg/kg）行胸髓横断。切除T 8 ～T 10 椎板，显微剪刀完全横断脊髓，脊髓断端间隙间填塞明胶海绵，关闭伤口。脊髓动物置于特殊笼中（抬头即可进食水）。每天腹部膀胱区挤压2～3次辅助排尿，直至膀胱反射建立。随后每天挤压1次排净残余尿。
相同方法麻醉，下腹正中切口显露膀胱，膀胱腹面左右两侧壁内分别使用10μl Hamilton显微注射器注射PRV液2.0μL（PRV，Bartha’s K株，10 8 /ml，由中国兽药监察所蒋玉文教授提供），注射后针头在膀胱壁内停留60s，拔出后压迫60s，逐层关闭伤口。注射病毒后，动物单独饲养，每天观察。所有动物无任何发病迹象。
1.2.2 切片制备 PRV注射既定时间后（见表1），深度麻醉下（上述麻醉剂量加倍）取膀胱，吸墨纸吸干后称重。经心脏灌注固定，先灌注250ml磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4），随后灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH=7.4）400ml。取全脊髓和L 6 ～S 1 背根神经节（DRG），4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液后固定6h，随后浸于30%蔗糖磷酸液4℃冰箱过夜。L 5 ～S 2 脊髓节段（从L 5 ～S 2 节段）、L 6 和S 1 DRG冰冻切片前称重。连续冰冻切片:L 6 ～S 1 DRG纵切片，脊髓横切片，片厚42μm。保留全部神经节切片，脊髓切片4片留1片，采用链霉卵白素-过氧化物酶（SP）免疫组织化学方法显示各组织切片中PRV阳性的神经元。
SP免疫组织化学过程如下:切片在0.3%H 2 O 2 PBS液 中室温下漂染1h，随后用0.2%兔正常血清PBS液孵育1h，山羊多克隆抗PRV抗体4℃孵育（1∶500，蒋玉文教授提供）24h。PBS冲洗后生物素化兔抗山羊抗体（1∶200，Zymed，USA）孵育2h，生物素/链霉-卵白素-辣根过氧化物酶复合物孵育2h，盐酸二氨基联苯胺（20mg/40ml PBS+75μL3%H 2 O 2 ）呈色，最后将切片表于挂过明胶的载玻片上，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
亮视野光镜下观察各切片。注射PRV后存活48～96h动物的脊髓神经切片中均发现PRV标记神经元，对照切片（0.2%兔正常血清代替一抗）未发现阳性神经元。通过隔张切片计数阳性细胞数，乘以8得出每只大鼠特定脊髓节段中PRV标记的后角（DH）细胞和运动神经核总数，计算各组相同注射PRV后存活时间大鼠特定节段和区域中阳性神经元的均数。应用Olympus Cue-2图像分析系统测定标记细胞轮廓的面积。L 6 和S 1 DRG之间、每节段左右DRG之间、脊髓切片左右两侧间各项测量值无显著差异，所以将各动物L 6 和S l DRG测量值以及左右DRG、脊髓测量值合而为一，取均值，随后计算各组阳性细胞面积。
1.2.3 统计学方法 所有参数用ˉx±s表示，各组间测量值比较采用one way analysis of variance检验（SPSS10.0统计包）（P<0.001为统计学有显著意义标准）。
2 结果
5只SCI b 和9只SCI c 大鼠注射病毒前死亡，SCI后2周内死于血尿或肠道功能障碍，2周后死于褥疮、神经性溃疡或难以控制的泌尿系感染。PRV注射后，无动物死亡。各组注射PRV后存活时间、各存活时间动物数目见表1。
表1 各组注射PRV后存活时间和相应大鼠数目 （略）
SCI b 和SCI c （慢性SCI）大鼠膀胱壁显著增厚、膀胱重量显著增加（P<0.001），non-SCI、SCI a 、SCI b 和SCI c 大鼠膀胱重量分别为（144±9）mg、（142±8）mg、（486±51）mg和（656±69）mg。各组间L 5 ～S 2 脊髓、L 6 或S 1 DRG重量无差异，见表2。
表2 non-SCI和SCI大鼠膀胱、L 5 ～S 2 脊髓、L 6 或S 1 DRG重量比较 （略）
non-SCI和SCI大鼠PRV示踪的时限性、分布相似。病毒注射2d后，一些L 6 ～S 1 DRG神经元出现病毒阳性、腰骶脊髓中仅副交感节前神经元病毒阳性。注射3d后，病毒标记L 6 ～S 1 DRG神经元增多、L 6 ～S 1 脊髓节段中间内侧带中间神经元和后角二级传入神经元出现病毒标记。脊髓切片PRV标记细胞左右分布对称，L 6 和S 1 脊髓节段分布相似。注射4d后，上述区域阳性细胞增多，前角一些运动神经元出现病毒标记。
慢性SCI后，PRV标记的DRG细胞面积显著增加（P< 0.001），见表3。non-SCI、SCI a 、SCI b 和SCI c大鼠分别为（593±40）μm 2 、（588±39）μm 2 、（815±53）μm 2 和（902±57）μm 2 。注射PRV后3d，与non-SCI和SCI a 大鼠相比，慢性SCI大鼠L 6 和S 1 脊髓节段后角阳性细胞数以及RLC（后角外侧半区域阳性细胞数/后角阳性细胞总数×100%）显著增加（见表3）;注射PRV后4d，慢性SCI大鼠L 6 和S 1 脊髓节段前角阳性运动细胞数较non-SCI和SCI a 大鼠增加，见表3。
表3 non-SCI和SCI大鼠L 6 或S 1 节段PRV标记DRG和脊髓细胞测量数据比较 （略）
注: ˇ DRG细胞面积，单位μm 2 ; △ TVH:PRV标记运动细胞数; # TDH:后角PRV标记细胞总数; ▲ RLC:后角外侧半区域阳性细胞数/后角阳性细胞总数×100%
3 讨论
本研究利用PRV跨突触示踪技术研究大鼠急性和慢性SCI后膀胱脊髓神经通路的改变，PRV方法学特异性是本研究的关键，Card等 ［10］ 和Rinaman等 ［11］ 电镜研究发现:注射部位的神经终端摄取PRV后，PRV沿支配脏器的周围神经逆行感染，病毒DNA在神经元核内复制，在Golgi体内获得膜结构，病毒颗粒对神经元胞体或树突的突触部位有亲合性，只有在突触部位才释放与突触前膜融合，跨突触进入下一级神经元胞体，依次特异感染多级神经元;在感染的突触周围有反应性胶质细胞和巨噬细胞增生，在病毒周围形成屏障，使病毒不能向细胞外间隙非特异性扩散，从而使病毒只能沿特异性路径传递到第二级甚至第三级以上神经元。本研究中PRV标记过程与以往文献报道相吻合 ［7，9］ ，这进一步说明PRV技术的可靠性。此外，本研究发现non-SCI和急、慢性SCI大鼠PRV示踪的时限性、分布相似，这说明SCI对损伤节段以下病毒跨突触示踪过程无影响，因此PRV示踪技术也可用于SCI后再生研究以及SCI后中枢反射通路重组研究。
本实验发现，与神经轴完整大鼠相比，慢性SCI大鼠排尿功能受损、膀胱扩张肥厚以及相应传入神经元肥大。KruseMN等 ［12］ 尿流动力学研究发现，慢性SCI大鼠出现DSD，导致功能性膀胱出口梗阻，膀胱内高压，最终引起膀胱和传入神经元的肥大。Steers等 ［13］ 报道，在部分结扎尿道的尿道梗阻大鼠中也观察到膀胱和传入神经元的肥大，去除尿道结扎，膀胱重量和神经元大小基本恢复至对照水平。在SCI大鼠将输尿管吻合至结肠或子宫进行尿液转流，也能防止膀胱和神经元的肥大 ［13］ 。这些研究提示靶器官的改变可影响支配该器官神经元的特性，膀胱传入神经元表型的变化很可能是与靶器官相互作用的结果，而不是与损伤脊髓作用的结果。Steers等 ［14］ 还发现，部分尿道结扎大鼠的肥大膀胱内神经生长因子（NGF）等营养因子水平升高;若大鼠存在拮抗NGF的自体免疫，则可减轻传入神经元的肥大程度。由此可见SCI后膀胱传入通路靶器官—神经相互作用可能是由靶器官组织产生的神经营养因子增高来介导的。
本研究发现，慢性SCI大鼠L 6 和S l 节段后角PRV标记细胞数以及RLC显著增加。Mallory B等 ［3］ 发现，在神经轴完整动物和SCI动物中调控LUT的反射通路显著不同，前者排尿反射通路由膀胱有髓Aδ传入纤维激活，而后者排尿反射传入支则由无髓C纤维构成。慢性SCI大鼠后角PRV标记细胞数和RLC增加可能与C传入纤维激发的反射出现有关。Thor K等 ［15］ 发现血管活性肠多肽（VIP）免疫活性（C传入纤维的标志）在SCI猫分布于后角外侧更大区域。这进一步说明了SCI后脊髓排尿反射通路出现改变。现可以认为，SCI后膀胱C传入纤维的功能特性发生改变，SCI后出现由无髓C传入纤维激发的脊髓排尿反射可能是SCI后膀胱过度活跃的主要原因。
本研究发现注射病毒后存活较长时间动物腰骶运动神经元出现阳性，这与Marson L ［9］ 发现相一致。现已知，支配LUT的副交感节前神经元的树突分布与支配尿道外括约肌的运动神经元树突分布相似，这说明这两群神经元可能接受脊髓内相同中间神经元和传导束的突触传入。因此笔者认为这些腰骶运动神经元可能是通过特定的脊髓中间神经元标记的。此外，本研究发现慢性SCI大鼠这些标记的运动神经元数目增多，笔者认为可能是SCI后调控膀胱和括约肌功能的中枢突触机制发生重组所致，这提示膀胱传入和传出信号的改变可将神经信息中转至支配尿道外括约肌的运动神经元。进一步对SCI后中枢突触机制重组进行更深入研究，可利于阐明SCI后导致DSD的机制，从而为临床SCI患者泌尿障碍研发新的治疗方法提供基础。
急性和慢性SCI对损伤水平以下PRV跨突触示踪过程无影响。慢性SCI大鼠的排尿反射通路出现显著重组。PRV示踪技术可作为研究SCI后再生和中枢神经系统重组的一种有效方法。
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（收稿日期:2004-07-27）
（编辑赵 艳）
作者单位:100700北京中医药大学东直门医院骨科中心