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【摘要】 目的 探讨阿霉素和缺血联合预处理对肝硬化肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。方法 （1）诱导大鼠肝硬化模型;（2）缺血再灌注损伤前3组肝硬化大鼠分别行阿霉素预处理、缺血预处理、阿霉素+缺血联合预处理，比较3组和对照组AST、ALT、LDH和ET、TNF-α、NO、热休克蛋白70（HSP70）差异有显著性。 结果 阿霉素预处理、缺血预处理、阿霉素+缺血联合预处理能明显抑制AST、ALT、LDH水平升高，其中以阿霉素+缺血联合预处理作用最显著;缺血预处理能显著降低ET、TNF-α水平;阿霉素预处理和缺血预处理使NO显著升高;阿霉素预处理能使肝细胞HSP70显著增加。 结论 阿霉素和缺血预处理都能减轻肝硬化肝脏缺血再灌注损伤程度;阿霉素+缺血联合预处理对肝硬化肝脏缺血再灌注损伤有协同保护作用。
关键词 阿霉素预处理 缺血预处理 肝硬化 缺血再灌注损伤
Synergetic protective effect of drug and ischemic preconditioning on cirrhosis livers with reperfusion injury
Yan Wei，Yu Zeli，Yan Li
Center of Transplantation，Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing100176
【Abstract】 Objective To determine whether pharmacological preconditioning（doxorubicin，DOX）and is-chemic preconditioning（IP）might produce protective effect on rat livers with cirrhosis and its probable mechanism.Methods （1）Induction of cirrhosis model of rats.（2）Before carrying out liver IR injury，3groups of rats were differ-ently preconditioned with IP，DOX and IP+DOX.Then compared the levels of AST，ALT，LDH，NO，ET，TNF-α，HSP70of every group with that of control group，and determine if they had significant difference.Results DOX pre-conditioning and IP significantly decreased serum AST，ALT and LDH，furthermore interaction of DOX preconditioning and IP had statistical significance and associating application of the two methods decrease serum AST，ALT and LDH to a lower level.IP significantly decreased plasma ET and serum TNF-α;DOX and IP significantly increased serum NO;DOX preconditioning improved the expression of HSP70in liver.Conclusion DOX preconditioning and IP have protective effect on liver with cirrhosis against subsequent ischemia-reperfusion injury.Associating application of the two methods may have synergistic protective effect.
Key words pharmacological preconditioning ischemic preconditioning cirrhosis ischemia-reperfusion in-jury
缺血再灌注损伤在肝脏外科领域非常常见，肝切除术中常需夹闭肝十二指肠韧带暂时阻断肝脏血流控制创面大出血，但时间较久将造成肝缺血再灌注损伤，严重者可导致肝功能衰竭。本实验欲探讨阿霉素、缺血预处理对肝硬化缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及肝硬化模型诱导 （1）健康雄性SD大鼠60只，体重150～200g，购自中国药品生命制品检定所实验动物繁育场（三级实验动物）。诱导肝硬化模型:应用30%四氯化碳橄榄油溶液以每100g体重0.2ml进行腹腔内注射，每周2次，诱导8周后随机抽取12只做肝组织病理学检查证实已形成肝硬化。
1.2 实验步骤 （1）其余48只大鼠随机分成4组，每组12只，应用2%戊巴比妥钠以40mg/kg腹腔注射麻醉。对照组（Control组）:分离并夹闭肝十二指肠韧带阻断肝血流40min，然后恢复血流60min，造成缺血再灌注损伤，下腔静脉取血并切取肝左外叶行病理学检查。阿霉素预处理组（DOX组）:手术前2d按1mg/kg经尾静脉注射阿霉素，手术操作同对照组。缺血预处理组（IP组）:分离并夹闭肝十二指肠韧带阻断肝血流10min，再灌注10min，余操作同对照组。阿霉素+缺血预处理组（DOX+IP组）:手术前2d按1mg/kg经尾静脉注射阿霉素进行预处理，术中先夹闭肝十二指肠韧带10min，再灌注10min，余操作同对照组。（2）检测和病理检查:①肝功能测定:全自动生化分析仪测定ALT、AST、LDH。②内皮素（ET）、肿瘤坏死因子（TNF-α）:用放免法按试剂盒说明书要求操作，应用放射免疫γ计数器测定（试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所）。③一氧化氮（NO）:用硝酸还原酶法测定N0 2- /N0 3- ，间接反映一氧化氮的含量，试剂盒购自晶美生物工程（北京）有限公司。④肝组织HSP70免疫组化染色:取肝左外叶常规福尔马林固定、石蜡包埋、切片，采用EnVision二步法进行HSP70免疫组化染色，光镜下观察有棕色着色颗粒的细胞中为HSP70阳性细胞，每张切片观察10个具有代表性的高倍视野，每个视野中计数100个细胞中的阳性细胞数，计算HSP70阳性细胞的百分率（HSP70抗体购自基因有限公司）。⑤肝组织形态学改变:病理切片行HE染色，光镜下观察肝脏病理学改变。
1.3 统计学方法 全部数据用ˉx±s表示，应用析因分析法比较各组AST、ALT、LDH、ET、TNF-α、NO及HSP70阳性细胞百分率差异有显著性，采用SPSS11.0统计软件分析。
2 结果
2.1 肝功能指标结果 DOX组、IP组和DOX+IP组AST、ALT、LDH水平显著低于Control组（P<0.01或P<0.05），而且DOX+IP组AST、ALT降低的更明显（P<0.05），见表1。
2.2 ET、TNF-α、NO及HSP70表达情况 IP组和DOX+IP组ET、TNF-α水平显著低于DOX组和Control组，说明IP能显著抑制ET、TNF-α升高（P<0.01）。
DOX组和IP组NO水平明显高于Control组（P<0.01或P<0.05），但DOX、IP组之间交互作用差异无显著性。DOX组和DOX+IP组肝细胞HSP70的表达显著高于IP组和Control组，说明DOX组能显著增加HSP70的表达（P<0.01），见表2。
表1 肝功能指标比较 （略）
注: * P<0.05， ** P<0.01
2.3 肝脏病理学改变 显微镜下可见各组肝切片都有明显的肝硬化表现:在肝硬化基础上可见Control组细胞缺血再灌注损伤程度最重，其次为DOX组和IP组，DOX+IP组损伤程度最轻。
表2 各组ET、TNF-α、NO及HSP70的表达情况 （略）
注: * P<0.05， ** P<0.01
3 讨论
缺血预处理是指预先使组织或器官经历短时间缺血，可增强其对随后较长时间的缺血再灌注损伤的耐受力。1986年Murry在实验中首次发现犬心脏的缺血预处理效应，此后在许多器官均发现类似现象包括:肝、骨骼肌、脑、脊髓、肾脏、视网膜、肺和小肠，说明该效应具有器官普遍性 ［1］ 。药物预处理是指应用特定的药物刺激机体产生应激反应，通过机体内在保护机制使身体产生对抗缺血再灌注损伤的能力，这些药物包括阿霉素［2］ 、前列腺素、潘生丁等。许多研究证实药物预处理和缺血预处理对正常肝脏有保护作用，但是否对肝硬化肝脏有相似的保护作用，国内外文献少有报道，而在临床上行肝切除的病人多有肝硬化基础，因此进一步研究预处理对肝硬化状态下缺血再灌注损伤有重要的临床意义。
AST、ALT和LDH是评价肝缺血再灌注损伤程度常用和敏感的指标。本实验结果显示:阿霉素预处理、缺血预处理和阿霉素+缺血联合预处理能显著抑制肝硬化大鼠AST、ALT、LDH水平升高减少肝损伤的面积，明显减轻缺血再灌注损伤程度，而且阿霉素和缺血联合预处理可产生协同作用，其保护效果最佳。
预处理的确切机制目前尚未完全阐明，目前认为预处理的机制可能与ET、TNF-α、一氧化氮（NO）、腺苷、蛋白激酶C和热休克蛋白等物质有关。
ET由于其强烈的血管收缩特性可造成肝脏微循环障碍，另外ET具有致炎作用，ET水平升高迅速诱导炎性细胞因子释放，导致炎性反应的发生 ［3］ 。本实验显示缺血预处理能显著抑制ET水平的升高，从而减轻肝脏微循环功能障碍、改善肝窦血流、减轻炎症反应、抑制Kuffer细胞释放TNF-α，最终减轻肝缺血再灌注损伤的程度 ［4］ 。
TNF-α作为一种炎性细胞因子在产生趋化因子、促使中性粒细胞聚集、加重缺血再灌注损伤中发挥十分重要的作用 ［5］ ，TNF-α和ET具有相关性，ET能激活肝脏内Kuffer细胞促进TNF-α的释放。本实验显示缺血预处理明显抑制缺血再灌注损伤后TNF-α的释放，这可能是由于缺血预处理通过抑制ET的释放，减少缺血再灌注损伤后Kuffer细胞的激活，从而减少TNF-α、IL-6等细胞因子的产生，最终可以抑制肝转氨酶升高和肝坏死区域的增加，达到减轻肝脏缺血再灌注损伤的目的 ［6］ 。
本实验显示阿霉素预处理、缺血预处理及两者联合预处理均能使NO明显升高，由此可见预处理可以通过保护性因子NO的生成增加达到保护肝脏的作用。缺血预处理的保护机制可能是通过诱导一氧化氮合酶（NOS）生成而使NO水平增加并触发各种保护反应、抑制ET水平升高及其活性 ［7］ 、下调TNF-α的表达、抑制各种细胞蛋白水解酶活性，最终减轻肝缺血再灌注损伤程度 ［8］ 。多数研究认为阿霉素预处理保护机制主要是通过热休克蛋白（HSP）表达增加而发挥保护作用，本实验证实阿霉素预处理也可促进NO水平升高达到保护作用，因此阿霉素预处理的保护机制比较复杂，除了如后所述的HSP70以外还和NO保护作用密切相关，其机制可能是阿霉素可在体内介导生成活性氧簇，介导细胞氧化应激反应，产生抗氧化损伤作用有关 ［9］ ，但其具体途径需进一步研究。
研究表明阿霉素除了抗肿瘤作用还可以诱导正常肝脏表达多种热休克蛋白，增加细胞耐受力，减轻缺血再灌注损伤。本实验证实对肝硬化肝脏行阿霉素预处理可以使肝细胞HSP70表达明显增加，HSP70保护作用的机制可能是在应激状态下作为保护性因子在保护细胞内蛋白、稳定细胞及细胞内结构中发挥重要作用，从而减轻肝脏的缺血再灌注损伤 ［10］ 。
目前认为阿霉素诱导的热休克蛋白主要在延迟阶段起作用，即应用阿霉素后24～72h效果最显著，而在急性期阶段作用不明显，这和本实验结果基本一致。
临床上行肝癌化疗的剂量约为1mg/kg，在此剂量下无明显的毒副作用。因此肝脏手术前应用阿霉素不但可以对肝脏进行辅助性化疗，而且还能增加肝脏对术中缺血再灌注损伤的耐受力。当然阿霉素的毒副作用也是需要注意的因素，其副作用主要与阿霉素介导产生的自由基损伤有关，而且副作用与其药物代谢动力学有关，因此需要注意确定适宜的个体剂量，尤其是在肝脏发生代谢功能障碍时更应注意 ［11］ 。
根据本实验研究，药物预处理（阿霉素）和缺血预处理对肝硬化肝脏缺血再灌注损伤也只有保护作用，而且联合应用两种预处理可以产生协同保护作用，在手术之前对肝脏进行联合预处理能保护器官避免发生严重缺血再灌注损伤，而且简单易操作，具有较好的临床应用价值。
参考文献
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8 Peralta C，Bulbena O，et a1.Strategies to modulate the deleterious effects of endothelin in hepatic ischemia-reperfusion.Transplantation，2000，70（2）:1761-1770.
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10 沈王羽，王非，方福德.真核基因表达调控.北京:高等教育出版社.施普林格出版社，1996，2:272.
11 Kume M，Yamamoto K，et al.Pharmacological hepatic preconditioning:involvement of70-kDa heat shock proteins（HSP72and HSP73）in is-chemic tolerance after intravenous administration of doxorubicin.British Journal of Surgery，2000，87:1168-1175.
（编辑莉 莉）
作者单位:100176首都医科大学附属北京同仁医院移植中心（△ 普外科）