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【摘要】 目的 探讨p27蛋白在肝门部胆管癌的表达及临床意义。方法 采用免疫组化方法测定44例肝门部胆管癌及8例正常胆管组织中p27蛋白的表达情况。结果 p27表达的阳性率为77.2%，以低表达为主。p27的表达与肿瘤的分化、淋巴转移及神经浸润显著相关（P＜0.05）。p27蛋白高、低及阴性表达组的平均生存时间分别为84个月、72个月与65个月。p27蛋白低表达组与缺失组的生存曲线明显低于高表达组生存曲线。结论 肝门部胆管癌中p27的表达是反映肝门部胆管癌生物学行为和判断预后的重要指标。
【关键词】 肝门部胆管癌;p27蛋白;免疫组化
Expression of p27 in hilar cholangiocarcinoma and its clinical significance
LI Zhu,ZHOU Ning-xin,LV Ya-li.Department of Hepatobiliary Surgery,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China
【Abstract】 Objective To discuss the expression of p27 in hilar cholangiocarcinoma and explore its clinical significance.Methods Forty-four hilar cholangiocarcinoma samples and normal bile ducts tissues were collected in General Hospital of PLA from 1996 to 2000.The expression of p27 was determined by immuneohistochemical method.Results The positive rate of p27 were 77.2% in cancerous tissues,but 100% in the control group.Meanwhile,p27 expression had a significant correlation with differentiation of hilar cholangiocarcinoma,lymph node metastases and perineural invasion.The survival curve of the group with low or absent p27 expression was significantly lower than that of the group with high p27 expression.Conclusion Our results suggest that aberrant expression of p27 maybe associated with the incidence and development of hilar cholangiocarcinoma and can be regarded as prognostic markers.
【Key words】 hilar cholangiocarcinoma;p27;immunohistochemistry
p27蛋白是一个重要抑癌基因，其表达水平降低减低了它对CDK或cyclin/CDK复合物活性的抑制效应，导致CDK的活化效应递增，使细胞能够完成细胞周期G1～S期的重要转换，驱动细胞周期的运行，而使细胞增殖与分裂过快、过多乃至肿瘤形成。目前已在多种肿瘤中予以报道。但是，其在肝门部胆管癌中的表达及其作用，至今国内外报道不多。本试验通过对44例肝门部胆管癌中p27的表达研究，探讨其生物学意义和临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料 选取我院1996～2000年经手术切除、术前未行放化疗、有明确病理结果及有详细随访资料的肝门部胆管癌标本44例，用中性福尔马林固定，常规石蜡包埋。其中男29例，女15例，中位年龄53岁(17～73岁)。按临床分期，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ期0例，Ⅳ期29例，其中Ⅳa期27例，Ⅳb期2例。其中高分化腺癌13例，中分化腺癌17例，低分化腺癌9例。对照组标本选取行根治性切除的胆管癌标本的远端切缘的正常胆管组织。
1.2 方法 鼠抗人p27蛋白单克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，工作浓度为1∶20。抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒购于上海基因有限公司。免疫组化染色采用两步法（做高温高压抗原修复）。用已知p27蛋白阳性的正常扁桃体组织（由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）作为阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。
1.3 结果判断标准 参考Michelangelo Fiorentino［1］p27蛋白以细胞核或胞核伴胞质内出现棕黄色颗粒为阳性结果，每张切片选5个高倍视野进行细胞计数，按阳性细胞数占同类细胞的百分比。p27的表达分为，高表达组：阳性细胞≥50%；低表达组：阳性细胞＜50%；及阴性表达组，无阳性细胞染色。
1.4 统计学方法 采用四格表χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比较采用Log-rank检验，以P＜0.05为差异有显著性。Kaplan-Meier曲线由Stata自动生成。
2 结果
2.1 p27蛋白在肝门部胆管癌中的表达 p27蛋白染色阳性细胞为细胞核着色。p27蛋白阳性率为77.3%(34/44)，以低表达为主。其中高表达14例（31.8%），低表达20例（45.5%），阴性表达10例（22.7%）。而对照组中，p27蛋白阳性率为100%(8/8)，以高表达为主。
2.2 p27蛋白表达与胆管癌临床病理的关系 肝门部胆管癌组织中的p27阳性表达与年龄、肿瘤分化、神经及淋巴的转移呈显著相关（P＜0.05）；p27在高、中分化的肝门部胆管癌中的阳性表达率明显高于低分化的肝门部胆管癌，两者差异有非常显著性（P＜0.01）。而p27表达与患者性别、年龄、肿瘤浸润深度、肿瘤分型［2］、血管转移、临床分期等无显著性相关（见表1）。表1 p27蛋白与临床病理参数的关系注：*P＜0.05，**P＜0.01
2.3 p27蛋白与生存随访的关系 所有病例皆有完整随访资料。p27蛋白高、低及阴性表达组的平均生存时间分别为84个月、72个月与65个月。p27高、低表达及缺失表达组各组生存率经Logrank检验，在统计学上差异无显著性，但在卡-迈二氏曲线上，p27的高表达组生存曲线明显高于低表达组与缺失组的生存曲线（见图1）。
图1 p27蛋白表达组生存曲线
3 讨论
p27Kip1是Polyk等［3］于1994年首先克隆出来的，为CDKI家族成员之一，主要作用于G1期，抑制cyclin/CDK复合物的活性，阻止pRb磷酸化，使细胞周期停滞于G1期，抑制细胞增殖。近年研究发现，在多种消化道肿瘤中［4～6］，p27Kip蛋白表达异常与肿瘤的进展和不良预后密切相关。
3.1 p27Kip蛋白表达异常原因 在本组病例中，p27蛋白阳性染色定位于肿瘤及正常上皮细胞的胞核内，不同于罗昆仑“p27主要位于肿瘤及正常上皮细胞胞浆”的报道［7］。本组病例中p27蛋白的阳性表达率为77.2%，不同于国内刘岳兰等［8］关于胆管癌的p27的阳性表达率为40.82%的报道。不同的原因考虑有：（1）取材导致混淆。国内有关胆管癌p27蛋白的研究的取材包括肝内、肝外及肝门部的胆管癌组织，其p27蛋白的阳性率不能代表肝门部胆管癌p27蛋白的阳性率。（2）可能和肿瘤位置的特异性有关。胆管癌不同部位的p27蛋白表达率不同。Michelangelo Fiorentino［1］进行了47例手术切除的肝内胆管癌，肝门部胆管癌22例与周围肝内胆管癌(peripheral intrahepati cholangiocarcinoma)25例的p27蛋白的检测，发现肝门部胆管癌的阳性率为59.1%，而外周性肝内胆管癌p27的阳性表达率则为88%。Jarnagin等［9］分析了1992～2002年间经手术切除的标本的细胞周期蛋白p53、cyclin D1、p21、Bcl2、p27、Mdm2和Ki-67的表达情况。其中胆管癌根据来源分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌、胆囊癌和远端胆管癌。结果发现p27的表达随胆树的近端向远端延伸而呈进行性下降，其得出结论：胆管癌表现不同的细胞周期蛋白，这些蛋白的表达取决于肿瘤位置和肿瘤的形态。
肝门部胆管癌组织中p27蛋白表达以低表达为主。Motagnolia等［10］认为：一旦受到恶性增殖信号的刺激，p27Kip1的蛋白表达水平下降，一方面由于合成降低，更主要的是通过细胞蛋白翻译后泛素蛋白酶体降解途径的速度提高。p27蛋白水平功能的下降减低了它对CDK或cyclin/CDK复合物活性的抑制效应，导致CDK的活化效应递增，使细胞能够完成细胞周期G1～S期的重要转换，驱动细胞周期的运行，而使细胞增殖、分裂过快、过多乃至肿瘤形成。我们推测p27蛋白在肝门部胆管癌中的低表达有可能缘于相同的机制。
3.2 p27在肝门部胆管癌进展中的作用 本试验高、中分化的肝门部胆管癌中的p27阳性表达率明显高于低分化的肝门部胆管癌，两者差异有非常显著性（P＜0.01）。这说明在高度恶性的肝门部胆管癌中p27的表达要低于恶性程度较低者，其可作为一个预示恶性程度的指标。
神经浸润是肝门部胆管癌的一个重要的转移方式。肝门处由于在解剖上神经、血管、淋巴管的紧密关系，肿瘤可能首先浸润小血管、淋巴管，在神经纤维周围形成“卫星”灶，继而浸润神经周围间隙［11］。本试验结果显示p27蛋白在无神经浸润的肝门部胆管癌中的阳性表达率显著高于已经发生神经浸润的腺癌（P＜0.01），说明p27蛋白低表达或阴性表达者易发生神经转移。同时，p27蛋白在无淋巴结转移组的表达阳性率明显高于淋巴结转移组。以上说明p27蛋白的低表达或丢失可促进细胞外基质的降解和改变细胞间的黏附力，促进肿瘤转移。
以上说明p27蛋白的表达程度与肿瘤的分程演变、分化程度密切相关，也就是说肝门部胆管癌的分化程度越低，肿瘤浸润范围越广，p27蛋白的表达就越低或缺失越高，这提示肝门部胆管癌的病程演变发展与p27蛋白缺失有关。这和国外报道相似［12］。以上充分说明p27是一种抑癌基因蛋白，在肝门部胆管癌的发生发展中起着重要作用。
3.3 p27与预后 p27高、低表达及缺失表达组各组生存率经Logrank检验，在统计学上没有显著性差异，但在卡-迈二氏曲线上，p27的高表达组生存曲线明显高于低表达组与缺失组的生存曲线，且高表达组的平均生存时间84个月明显长于低表达组及缺失组的中位生存时间，后者分别为72个月与65个月。当增加样本量时可望得到各组生存率存在差异性的结论。这说明p27高表达组的预后要好于低表达组及缺失组。
综上所述，p27是一个抑癌基因，可抑制细胞恶性增殖。p27蛋白的减少或缺失与肝门部胆管癌的的发生、进展、转移及预后有密切关系，可望成为一个预测肝门部胆管癌术后复发的指标。对p27的进一步研究，有助于深入了解肝门部胆管癌的发生、发展机制，并可为判断预后提供一定的依据，有利于改善预后。
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作者单位： 100853 北京，解放军总医院肝胆外科（△病理科）
(编辑：商 洁)