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随着人民生活水平的提高，动脉粥样硬化、高血压、高血脂、糖尿病的发病率逐年上升，因这类疾病引发的心、肾、脑、四肢血管狭窄、闭塞导致相应器官缺血已成为主要的致残致死原因，严重威胁人类生命和健康，各种介入性血管腔内手术、动脉内膜剥脱术、动脉旁路转流术等治疗方法在临床上已广泛开展，能快速缓解缺血症状，大大提高了患者生存率和生活质量，术后近期效果好，但有30%～50%的患者会在术后3～6个月内出现进行性再狭窄，直至管腔闭塞，导致这类手术远期效果降低甚至失败。很多研究表明血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增生是导致管腔再狭窄的关键。国内外大量分子生物学实
验研究认为VSMC的过度增生与多种调控基因有关，现将参与血管平滑肌细胞周期调节活动的相关因子及针对细胞周期的药物和基因治疗进行综述如下。
1 血管平滑肌细胞增殖与细胞周期
血管增生是血管壁组织对机械性因素、高血压、高血脂等损伤所产生的反应，可分为3个阶段：（1）早期炎症反应、血小板激活和血栓形成：因高压血流冲击管壁、高血脂引起的斑块形成和脱落，以及手术操作造成的内皮细胞受损脱落，引起局部血小板沉积和激活，白细胞和巨噬细胞单核细胞向损伤部位聚集，并分泌各类趋化因子和生长因子；（2）SMC聚集形成新生内膜：中膜的VSMC受趋化因子吸引向内膜层迁移，并在内膜层里受各类生长因子的诱导进入有丝分裂期，大量增殖超过自然凋亡水平，这样就形成了新生内膜使得管腔发生狭窄；（3）晚期增生阶段：新生内膜里的VSMC能分泌大量基质成分并沉积下来，使管腔进一步狭窄［1］。
与其他细胞一样，SMCs增殖也是DNA复制和有丝分裂的周期性活动。细胞周期（cell cycle）指细胞从前一次分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间称为细胞周期时间。休眠期里的SMC处于非增生状态（G0）；激活的SMC进入第一个间期（gap1，G1），在该期里细胞复制合成DNA所需要的因子。然后进入S期进行DNA复制，随后细胞进入第二个间期（gap2，G2），在这期里进行必要的检查及修复以保证DNA复制的准确性并为蛋白质合成做准备。接着是有丝分裂期（mitosis，M）完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二，这样便完成了一个细胞周期。调节G1到S期之间和G2到M期之间的进程能保证细胞周期有序地进行或被阻滞。尽管不同物种的上游有丝分裂信号会有所不同，但在细胞周期活动中主要的细胞因子是共同的，也是可以检测的。
2 CDK/CDKI和CyclinI对细胞周期控制
2.1 CDK/CDKI CDC2是细胞周期蛋白依赖激酶(cyclindependent kinase，CDK)，要与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，因此CDC2又被称为CDK1。目前已知CDK家族有7个成员：即CDK1～7，这些分子都含一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，与周期蛋白的结合有关。激活的CDK家族可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。这些效应的最终结果是细胞周期得以不断运行。因此，CDK作为正性调节因子和其负性调节因子CDKI一起被称为“细胞周期引擎”。
CDKI是细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子（CDK inhibitor，CDKI），对细胞周期起负调控作用，目前发现的CDKI有两大家族：（1）Ink4(inhibitor of cdk 4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6·cyclin D1复合物；（2）Kip(kinase inhibition protein)：包括P21cip1(cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，P21cip1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）结合，直接抑制DNA的合成。
在生理条件下，CDKIS通过抑制它们各自的CDKs来调控细胞周期里的活动。CDK/CDKI间的表达失衡也许是造成血管壁细胞增生的重要因素，因此维持CDK/CDKI间的平衡表达可能阻止SMC增殖抑制血管壁增厚［2］。
2.2 周期蛋白(cyclin) 不仅能激活CDK，还决定了CDK的作用时间、部位和底物磷酸化，从而推动细胞周期的前进。目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种，在脊椎动物中为A1～2、B1～3、C、D1～3、E1～2、F、G、H等。不同的cyclin亚型和CDK亚型又组成G1型、G1/S型、S型和M型4种激酶复合体形式。细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录［3］。
细胞周期机制调控是增生反应的最终共同通路，目前各种不同的动物模型研究显示：血管损伤后Cyclin、CDKs和CDKIs有着很高的相关性表达。这就为干预细胞周期调控提供了可能、合理的切入位点。如何使细胞周期抑制剂安全地进入临床使用，有效地抑制VSMC增生防治再狭窄，同时其副作用又是最小的，这些都已成为目前的研究热点。
3 现有的细胞周期干预方法及效果
3.1 抗细胞增殖药物即抗肿瘤药
3.1.1 抑制CDKs家族的药物 以细胞周期作为靶位，因此可通过阻断CDKs的ATP联合位点的方法，用低分子量复合物特异性地干扰细胞周期蛋白是一项很有吸引力的药物性方案。由于CDKs里的ATP联合位点在结构上不同于其他激酶，具有特异性。Flavopiridol是一种从印度植物叶和根中提炼的植物碱，是美国第一个针对细胞周期进入临床试验的可口服低分子量药物，能有效地阻断CDK1，CDK2、CDK4和CDK7的活性，但它对其他激酶有微量副作用。美国得克萨斯医学分部实验室的研究显示：在体外Flavopiridol能抑制SMC增生；也能在体内大鼠颈动脉球囊损伤后模型中，抑制SMC增生［4］；CVT-313，是嘌呤类似物olomoucine的衍生物，是另一种药物性CDKIs家族成员之一，尽管它比flavopiridol的药效少些但也能抑制CDK2的活性，在大鼠颈动脉球囊损伤后模型局部用药能抑制损伤后狭窄的形成［5］。
3.1.2 阻断G1期到S期进程的药物 间接抑制细胞周期进程的药物可作为血管增生抑制剂。rapamycin雷帕霉素(Rapamune,Sirolimus西罗莫司)，一种可口服的大环内酯类抗生素；还有Paclitaxel(Taxol)泰素，也是一种化疗药物，都能阻断SMCs细胞周期的G1期。Paclitaxel能稳定聚合的微管并能持久阻断血管SMC细胞周期，在动物模型中全身给药和心包内注射给药后抑制新生内膜形成［6~8］。Rapamycin还能联合细胞溶质免疫球蛋白FKBP12，有效地抑制SMC增生。用Rapamycin包被支架进行的初步研究结果表明它在抑制血管腔内治疗后再狭窄方面具有很大的潜力。事实上，我们也许正在使用某些细胞周期活动调控药物而不自知，比如体外实验研究显示一氧化氮和高剂量的水杨酸类药物能抑制细胞周期和SMC增生［9］，也许在体内实验中也有类似效果。
3.2 基因转入调控细胞周期进程
3.2.1 调节内源性基因表达和活性 内源性的基因表达能通过反义技术来下调，这要求反义DNA和RNA分子有连接到mRNA分子的能力，用一个顺序特异性方式来增加RNA的降解。基因活性也能通过转录因子诱导技术进行负性调节，该技术利用转录因子的单核苷酸一致性连接顺序，以完全地保护它们的功能。细胞周期调节因子特异性的反义寡核苷酸细胞周期调节基因包括：周期素B1、增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞分裂周期2（CDC-2）激酶和周期素依赖激酶2（CDK2）的基因［10］。Mann等［11］的研究认为，静脉移植物在体内存在2种主要反应：一种是手术时因操作和缺血引起的损伤，这促进了新内膜的形成并发展为动脉粥样硬化［12］；另一种是腔内压升高与动脉环境下静脉壁承受的高切应力，这种力在血管无损伤时可促使血管增生肥厚而无新内膜形成，即静脉的“重塑”——动脉化过程［13］。处于G0/G1期的VSMC可不经细胞周期进行细胞的过度生长并产生细胞外基质蛋白。因此，阻断促VSMC进入复制期的必需基因表达会使移植静脉的血管壁增厚，同时抑制VSMC的迁移和增殖，从而抑制新内膜形成。周期素B1、PCNA、CDC2和CDK2激酶基因特异性反义寡核苷酸正是据此而设计的。Mann等［11］的研究结果表明，PCNA、CDC2激酶的基因特异性反义寡核苷酸可选择性地阻断这些激酶在移植于颈动脉的颈静脉VSMC中的表达，从而指导静脉移植物由新内膜增生向中膜肥厚发展，使移植的静脉更类似于动脉结构。在新生内膜形成的动物模型里，用多聚阳离子脂质体复合物转导反义单核苷酸和RNAs，能对抗CDK1和CDK2，Cyclin B1和G1从而得到有效的抑制效果［14］。更重要的是，这些基因工程化的移植物可抵抗高脂饮食诱导的动脉粥样硬化，因而有希望提高移植血管的远期通畅率。
3.2.2 增加外源性基因表达 用病毒或质粒为载体转入外源性细胞周期抑制剂基因表达相应分子。用腺病毒技术使CDKIs P21和P27过度表达是防止新生内膜形成的有效方法，同样，用裸质粒载体使细胞周期抑制剂转录因子P53、GAX过度表达也有此效果［15，16］。
1995年后，CHANG等学者用腺病毒载体携带CDK抑制剂，即一个KIP/CIP家族成员P21，感染大鼠颈动脉。在损伤后20天，P21的过量表达能减少内膜/中膜比值（I/M）46%［17］。体内分析显示：P21通过使血管SMCs停止在G0/G1细胞周期而产生这种抗增生作用。P21基因转染抑制内膜增厚的作用已被另一项大鼠和猪动脉损伤模型研究证实［18，19］。此外LUO等对啮齿类动物模型中，每个动脉斑块上用腺病毒P21低倍1×108效价转染，能减少58%的新生内膜形成［20］。另一个CDK抑制剂的KIP/CIP家族成员是P27，它在大多数细胞里有持续表达。在大鼠颈动脉里过度表达P27也能减少I/M 49%［15］。所以，过度表达自身细胞周期抑制物能阻遏细胞周期，抑制SMC增生，最终起到限制内膜增厚的作用。
在细胞遭受非常严重的损伤和DNA破坏后，DNA修复或激活凋亡病理过程时，肿瘤抑制物P53基因就会被诱导和启动以阻止细胞周期过程。这些P53的特性使其成为一个具有吸引力的血管基因治疗后备基因。Yonemitsu等［21］报道：日本血细胞凝集病毒（HVJ）作为介质转导P53到球囊损伤的兔颈动脉能显著地抑制内膜增厚。组织学上检测这类经P53处理过的血管显示：细胞增生被抑制，同时SMC分化也被削弱。还有，Scheinman等［22］报道：腺病毒将野生型P53转导到损伤的大鼠颈动脉会产生剂量依赖的新生内膜形成减少，在8×109、1.6×1010、8×1010PFUm/L分别能减少内膜厚度47%、51%和96%。
GAX过度表达已至少在3种不同的血管增生模型里显示出有效［23，24］，GAX过度表达的检测是基因治疗血管疾病领域里最严格精密的检测之一。还有促使一氧化氮合酶异构体过度表达，在动物模型里也能减少新生内膜形成，其机制可能是一氧化氮和细胞周期机制间的相互作用［25］。Smith等［26］报道腺病毒携带GAX到损伤的大鼠颈动脉，能减少69%的新生内膜。Maillard等［27］学者的报道也显示了同样的结果，即能使兔髂动脉的I/M减少69%。另一项类似GAX的转录因子GATA-6也能在啮齿类动物抑制50%的内膜增厚［28］。
但是SMC对不同的细胞周期抑制剂的反应并不一致。例如，P16 INK4在阻断CDK2活性方面不如P21或P27有效，它是一个弱的血管增生反应抑制剂［29］。
SMCS细胞周期抑制剂不仅使SMC处于持续的静息状态，凋亡也是细胞周期抑制的可能结果，比如，在大鼠颈动脉里过度表达GAX在抑制增生同时还会引起凋亡［30］。而且SMC的凋亡存在于整个基因治疗的效应期。
要强调的是，用腺病毒和质粒转导的外源性基因的表达，大多也是暂时性的，由于腺病毒刺激机体产生免疫反应阻止了该技术的重复应用，因而大大降低了实用性。用基因方法防止血管增生性疾病的动物研究结果虽然说明基因治疗具有临床应用潜力，还存在着很多问题。除了与种系相关的明显差异外，还有在动物研究里的基因类物质转导通常是通过直接灌注到手术取下的血管里，这个方法远不同于目前人体以导管为基础的操作。当考虑将基因治疗作为临床心血管治疗方案时，在安全性、免疫遗传学或基因表达稳定性方面都要求理想［31］，因此也必须提高关于病毒为基础的基因转导方法学，或开发其他基因携带物，比如壳聚糖纳米等可备选的方法。
4 讨论
综上所述，用抑制细胞周期的方法防治血管增生性疾病与抗肿瘤治疗虽然有着相似之处，但并不完全相同，而且还有许多问题需要进一步研究探索。
4.1 两者给药方式不同 抗肿瘤治疗已经形成临床常规，常在术前、术中及术后全身用药，术后用药多为长期比如6～12个月，以静脉给药为主，也有口服给药的方式。而针对血管增生性疾病的抗增殖治疗还处于科研探索阶段，一般对动物模型的给药方式为手术操作中局部进行反义基因的转染或放置包被抗增殖化疗药物的支架，大多为一次性局部用药。关于药物包被支架的应用虽能延长给药时间，但当药效消失后支架放置本身也会引起巨单核细胞聚集在支架周围引发一系列肉芽肿性增生反应，所以现在也有研究可溶性药物支架，这类支架应用的前景有待进一步研究。也有实验研究用微泵固定于实验动物身上的给手术部位持续性血管内给药，以达到抗术后血管增殖作用，但这属于有创性治疗要在临床上推广有一定限制。而临床上人体的再狭窄常开始于术后6～12个月，并在更长的时间内进展直至管腔完全闭塞，在这么长的时间内术中给的药或反义基因是否已被代谢，或当初转染反义基因的细胞凋亡，该基因又未传代下去，使得防治再狭窄的作用失效或效力不足？但也可能术中给药能抑制增生的起始，使得增生能一直处于一个较低的状态从而使再狭窄发生推迟或不再发生，所以是术中一次用药还是需要多次用药，如果需要术后持续用药，那么该方式又必须是损伤最小的，这需要进一步的动物和临床研究。
4.2 用药剂量问题 临床上肿瘤的抗增殖药剂量一般已定，而使用抗增殖药防治血管增生性疾病还处于实验阶段，没有一个可循的用量范围，因为在静脉移植术后静脉发生的增殖也是对血流动力学环境改变后的适应，只是它发生的不是“动脉化”而是偏离动脉功能的变化；在动脉粥样硬化斑块中增生的VSMC能稳定斑块不易破裂，如果VSMC凋亡过多斑块就会变得不稳定导致更严重的后果；还有手术中会造成一定的内皮损伤，不完整的内皮会引起血栓形成直接导致早期的血管手术失败。所以如果抗增殖用药量过大是否会引起移植的静脉壁薄弱易造成动脉瘤甚至破裂，或使得动脉粥样硬化斑块易破裂，或因内皮修复也受到了抑制更易形成血栓等这类适得其反的结果。所以必须要研究出各抗增殖药物有效和安全的剂量范围，在这个范围内既能达到最大抗增殖效果，又不会出现上述副作用。
4.3 抗增殖的副作用 众所周知，抗肿瘤药会有一定副作用，如胃肠道反应、脱发、白细胞减少等。防治血管增生疾病的抗增殖治疗虽多为局部用药，但毕竟是在血管腔内用药，药物是否会随着血液循环到身体各处引起类似的副作用，还有作为载体的病毒颗粒引起的免疫反应和质粒如何安全排出体外等问题都需进一步研究。既可靶向转导，又无毒、无免疫源性，还可示踪定量检测的载体也将成为研究的热点。
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作者单位： 200020 上海，上海瑞金医院分院-卢湾区中心医院
(编辑：朱兆耘)