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【摘要】 目的 观察Ghrelin对重症急性胰腺炎大鼠胃肠运动的影响，同时探讨其机制。方法 Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、Ghrelin治疗组，测量肠转运系数；全细胞膜片钳技术记录各组大鼠胃窦环形平滑肌细胞钙敏感性钾电流的数值变化。结果 模型组大鼠肠转运系数明显低于对照组（P<0.05），钙敏感性钾电流高于对照组（P<0.01）；治疗组转运系数高于模型组（P<0.05），而电流明显降低（P=0.01）。结论 重症急性胰腺炎大鼠的胃肠运动减弱，胃肠道平滑肌细胞膜钙敏感性钾电流增加是一个重要的电生理机制，Ghrelin可以通过降低该电流而促进其胃肠运动。
【关键词】 Ghrelin 重症急性胰腺炎 胃肠运动 膜片钳 钙敏感性钾电流
Influence of Ghrelin on gastrointestinal motility in severe acute pancreatitis rats and research on mechanism
ZHOU Xiao-lei，ZHANG Jian-sheng，XUE Cheng-rui.Department of Surgery Integrated Traditional and Western Medicine，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China
［Abstract］ Objective To observe the influence of Ghrelin on gastrointestinal motility in severe acute pancreatitis (SAP) rats，and study on its mechanism.Methods Wistar rats were randomly divided into control group，SAP model group and Ghrelin treatment group.The changes of their intestinal transit index were measured;The whole cell patch clamp technique was used to record the calcium activated potassium current of their gastric antral circular smooth muscle cells.Results The intestinal transit index of model group was lower than that of control group（P＜0.05），and its calcium activated potassium current was higher than control group（P＜0.01）;The index of Ghrelin treatment group was higher than that of control group（P＜0.05），and its current was lower than control group（P=0.01）.Conclusion The gastrointestinal motility of severe acute pancreatitis rat was attenuated，the mechanism of which might be the calcium activated potassium current of its gastrointestinal smooth muscle cell was increased.Ghrelin can promote the gastrointestinal motility of severe acute pancreatitis rat with cutting down the currents.
［Key words］ ghrelin;severe acute pancreatitis;gastrointestinal motility;patch clamp;calcium activated potassium current
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种发病急、并发症多且死亡率高的疾病，有效地控制后期感染和内毒素血症的发生是治疗SAP的关键。通过促进胃肠蠕动排泄毒素，可以达到调整肠道微生态平衡，减少内毒素吸收的作用，Ghrelin是生长激素促分泌剂（GHSs）受体的内源性配体，在胃肠道表现出和胃动素类似的促进胃肠运动作用，本研究以胆盐诱导的重症急性胰腺炎大鼠为模型探讨Ghrelin对其胃肠运动的影响，并且通过观察胃窦平滑肌细胞膜钙敏感性钾电流［calcium activated potassium currents，IK（Ca）］的变化进一步对其作用机制进行探索。
1 材料与方法
1.1 动物分组与模型建立 Wistar大鼠54只随机分为对照组（假手术组）、急性胰腺炎组（模型组）、Ghrelin治疗组，每组18只，各组又分3个时间亚组，每组6只，分别于术后6 h、12 h、24 h时间处死。大鼠以10％水合氯醛麻醉后，开腹寻找胆胰管十二指肠乳头开口，使用一次性静脉留置套管针于对系膜缘肠壁穿刺，将套管经乳头部逆行插入胆胰管约1cm，小动脉夹于肝门部阻断胆管后，套管末端接微量泵，以0.1 ml/min的速度匀速注入3.5％牛磺胆酸钠（1 ml/kg体重）后关腹。对照组大鼠开腹后仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次后关腹。Ghrelin治疗组于造模前30 min、造模后3 h给予Ghrelin（加拿大Phoenix Pharmaceuticals公司）10 nmol/kg腹腔注射，余处理同模型组。
1.2 胃肠转运功能测定 各组大鼠于处死之前30 min自口腔插入鼠胃管，注入50% Evan blue染料0.5 ml，注完染料30 min后，用木棒击头致昏，破心放血后开腹显露全胃，测量幽门至蓝染距离与整个小肠（幽门至回盲部）的长度比，用百分数表示为转运系数，反映胃肠道转运功能情况。
1.3 胃窦环形平滑肌细胞IK（Ca）的测定
1.3.1 试剂与仪器 Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白等均购自美国Sigma公司。美国Axon Instrument公司Multiclamp 700B膜片钳放大器和Digdatal1322A模-数/数-模转换器，日本Nikon公司TS100倒置显微镜，美国ALA Scientific Instruments公司DADVC-8PP型8通道灌流系统。
1.3.2 主要溶液［1］ 台氏液（mmol/L）：NaCl 147，KCl 4，CaCl2 2，NaH2PO4 0.42，Na2HPO4 2，MgCl2 1.05，葡萄糖 5.5，以NaOH调pH 7.4。PSS（mmol/L）：NaCl 134.8，KCl 4.5，HEPES 10，MgCl2 1，葡萄糖10，CaCl2 2，以Tris调pH 7.4。电极内液（mmol/L）：天冬氨酸110，M g-ATP 5，HEPES 5，MgCl2 1，KCl 20，EGTA 0.1，di-tris-creatine phosphate 2.5，di-sodium-creatine phosphate 2.5，以KOH调pH 7.3。
1.3.3 单个胃窦环形平滑肌细胞的分离 选取对照组和模型组大鼠各10只，模型制备方法同上，造模后12 h处死动物显露全胃。剪取角切迹右侧至幽门的部分（胃窦部），放入氧饱和的台氏液中，剪开胃窦部，剪除黏膜层后即可暴露出环行肌层，沿环行肌走行方向用剪刀剪取1 mm×5 mm的环行肌条。用含1％Ⅱ型胶原酶、1％胰蛋白酶抑制剂、2％牛血清白蛋白的消化液于37 ℃水浴振荡消化15 min，然后置于4 ℃冰箱中备用，实验前用吸管反复吹打后，取上清液可得单个胃窦环形平滑肌细胞。
1.3.4 钙敏感性钾电流IK（Ca）的记录 取各组大鼠分离细胞悬液接种于灌流槽中，细胞贴壁后PSS灌流以清除悬浮的细胞碎片。形成吉欧封接后，高电压脉冲击破细胞膜形成全细胞记录模式，进行参数补偿后开始实验参数记录。将细胞膜电位钳制在-60 mV，以每10 s给予20 mV的阶跃刺激使细胞膜电位从-60 mV去极化至100 mV，时间持续400 ms，分别观察PSS和含10 nmol/L Ghrelin的PSS灌流下IK（Ca）的数值变化。
1.4 统计学方法 采用膜片钳数据软件Clampit 9.2和统计软件SPSS 13.0进行数据分析，在每一细胞上所取得原始电流值进行归一化处理，除以对照组中的最大电流值得出其相对值。实验结果均以（x±s）表示，多个样本均数间比较用单因素方差分析（one way ANOVA），均数间两两比较用LSD检验。
2 结果
2.1 一般情况 对照组各亚组均无死亡；模型组造模后6 h组无死亡，12 h组死亡1只，24 h组死亡3只；治疗组造模后6 h组无死亡，12 h组死亡1只，24 h组死亡2只。
2.2 肠道转运系数 模型组肠转运系数明显低于对照组（P<0.05），治疗组转运系数均高于模型组（P<0.05），并且各组转运系数均随时间有所增加，见表1。表1 肠转运系数的比较 注：与模型组比较，#P<0.05；与前一时间亚组比较，*P<0.05
2.3 钙敏感性钾电流IK（Ca）的变化 在PSS灌流下，模型组大鼠与对照组相比，胃窦环形平滑肌细胞IK（Ca）增加，当细胞膜电位去极化至+60 mV时，模型组IK（Ca）的平均幅度为（2.03±0.20）nA，对照组为（1.63±0.17）nA，电流增加差异具有显著性（P<0.01）；在含10 nmol/L Ghrelin的PSS灌流下，模型组大鼠与PSS灌流时相比，IK（Ca）明显降低，当细胞膜电位去极化至+60 mV时，模型组IK（Ca）的平均幅度为（1.83±0.13）nA，与PSS灌流下相比，电流降低差异具有显著性（P=0.01），见表2，图1。表2 细胞膜电位去极化至+60mV时IK（Ca）的变化注：与对照组比较，#P<0.01；与PSS灌流比较，*P<0.05
3 讨论
急性胰腺炎早期，胰酶的活化，炎性介质、细胞因子和氧自由基的诱生引发的机体超强的炎症反应是造成早期病理损害的主要原因，但随后的肠源性细菌移位导致的严重感染和内毒素血症造成了后期病理生理的恶性循环，对机体产生第二次打击，引发严重的多脏器衰竭。目前研究认为，SAP时促进细菌移位的机制主要包括：（1）SAP时胃肠运动功能的改变，如胃肠动力减弱，肠腔积液积气，肠管扩张等，为肠道内细菌的滞留和过度繁殖创造了条件，引起以革兰阴性菌为主的肠道需氧菌过度增殖，而双歧杆菌和乳酸杆菌明显减少，破坏了肠道微生物的平衡［2～4］；（2）肠道黏膜屏障的通透性增加。SAP时，肠道作为机体应激的中心器官之一，早期即可出现肠道屏障功能损伤，其机制复杂，可能与多方面因素有关［5～6］；（3）宿主免疫功能下降。这些因素相互协同作用，促进细菌向肠腔外其他部位移位。本实验中模型组大鼠肠转运系数明显低于对照组（P<0.05），证实了SAP下大鼠的胃肠运动减弱，是促进肠源性细菌移位，进而导致严重感染和内毒素血症的一个重要因素；通过促进胃肠蠕动排泄毒素，可以达到调整肠道微生态平衡，减少内毒素吸收的作用。Ghrelin是生长激素促分泌剂（GHSs）受体的内源性配体，在胃、小肠的神经和肌肉组织中均有其受体的表达，Ghrelin可以通过胆碱能神经元刺激消化间期胃及小肠的运动［7］，有实验显示大鼠静脉注射Ghrelin后，胃排空和小肠对流质饮食的传送加快，并可逆转手术后肠梗阻［8］。此外Ghrelin作为一个胃肠激素，与胃动素（motilin）的分子结构相似，在胃肠道表现出和胃动素类似的促进胃排空作用，可能是由于Ghrelin和胃动素受体之间存在相互作用有关［9］。本实验中Ghrelin治疗组大鼠肠转运系数显著高于模型组（P<0.05），这与以前的实验结果相一致，说明Ghrelin可以通过促进胃肠运动，调整肠道微生态平衡，减轻内毒素吸收，实现对SAP的治疗作用。
大多数胃肠道运动的抑制性反应都与胃肠道平滑肌细胞膜的超极化有关，胃肠道平滑肌超级化的离子机制尚不清楚，很多实验表明这种超极化可能是由于各种原因使钙敏感性钾电流IK（Ca）增加引起的，如生理性舒张，包括吞咽后食管下括约肌舒张、进食后胃的容受性舒张和胃肠道扩张后的下行性抑制性蠕动反射等；病理性舒张，包括功能性消化不良、反流性食管炎、巨结肠症。当细胞内钙离子浓度因各种原因少量增加时可激活IK（Ca），引起钾离子外流增加，使细胞膜发生超极化，细胞兴奋性下降，出现胃肠道运动的抑制性反应。胃窦在形态结构上肌层最发达，在胃排空中起泵的作用，在本实验中模型组大鼠与对照组比较，肠转运系数显著降低，胃肠运动减弱，而胃窦环形平滑肌细胞IK（Ca）显著增加（P<0.01），表明胃肠道平滑肌细胞膜IK（Ca）增加是SAP下大鼠胃肠运动减弱的一个重要电生理机制；在Ghrelin灌流下，模型大鼠的胃窦环形平滑肌细胞IK（Ca）显著降低（P=0.01），说明Ghrelin可能是通过降低IK（Ca）电流而促进SAP大鼠胃肠运动的。在以前的实验中我们已经证实Ghrelin对重症急性胰腺炎大鼠具有明确的保护作用，其机制可能是通过影响炎症传导通路来实现的，本实验的结果表明Ghrelin对胃肠运动的促进作用，减少了内毒素吸收，减轻了SAP对机体的第二次打击，也是其保护作用的一个重要机制。
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作者单位：300052 天津，天津医科大学总医院中西医结合外科