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首页医源资料库在线期刊中华现代外科学杂志2011年第8卷第1期

120例结直肠腺癌中HPV16、18型感染率的基因研究

来源:中华现代外科学杂志
摘要:【摘要】目的研究高危型人乳头瘤病毒(high-riskhumanpapillomavirus,HR-HPV)16、18型在结直肠腺癌中感染的情况,以确定结直肠腺癌与16、18型HPV感染的临床发病的关系,并为结直肠癌的防治提供新的思路和路径。方法共提取120例结直肠腺癌的石蜡组织以及30例正常人肠黏膜的石蜡组织标本中的16、18型HPV基因......

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【摘要】  目的 研究高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)16、18型在结直肠腺癌中感染的情况,以确定结直肠腺癌与16、18型HPV感染的临床发病的关系,并为结直肠癌的防治提供新的思路和路径。方法 共提取120例结直肠腺癌的石蜡组织以及30例正常人肠黏膜的石蜡组织标本中的16、18型HPV基因组中特异性的DNA核酸片段, 采用实时荧光定量PCR,对16,18型HPV特异性的DNA核酸片段进行扩增检测,按3种阳性感染情况分组并进行统计分析。 结果 在120例结直肠腺癌组织中直肠腺癌总的HPV感染率为77.53%(69/89)、乙状结肠腺癌总的HPV感染率为73.33%(11/15)、升、横、降结肠腺癌总的HPV感染率为62.50%(10/16),其中,16、18型HPV 感染27例,其感染率为22.50%(27/120);16型HPV 感染23例,其感染率为19.17%(23/120);18型HPV 感染40例,其感染率为33.33%(40/120),结直肠腺癌组织中总的HPV感染率为75.00%(90/120)。 结直肠腺癌以18型感染为主,其次为16、18型,16型感染率最低。结论 120例结直肠腺癌组织中总的HPV感染率为75.00%(90/120)。就16、18型HPV 感染率来说,其感染率与宫颈鳞癌的16、18型HPV 感染率在70%左右相比非常相似,提示16、18型HPV 感染与结直肠腺癌的发生发展密切相关,可能是结直肠腺癌发生的主要因子。 在结直肠腺癌组织中存在着16、18型HPV 感染灶,其感染灶部位距肛门越近,感染率越高。在40岁以上的人群中开展高危型HPV的研究以及肛门直肠的细胞学检查,将对结直肠腺癌的防控具有非常重要的意义。

【关键词】  人乳头瘤病毒(HPV);结直肠腺癌;HPV16、18型;实时荧光定量PCR

[中图分类号]  R735.3        [文献标识码]  A        [文章编号]  1681102X(2011)01000105
Study on the rate of HPV16,18 types infection among 120 patients with colorectal adenocarcinoma
LONG Xiu-rong, GENG Jian-xiang, FAN Zhi-ming, et al. Department of Pathology ,Third Affiliated Hospital of Nanjing Traditional Chinese Medical University , Nanjing 210001, China
[Abstract]  Objective  To study the high-risk human papillomavirus(HPV)infection is often related to cervical cancer and other cancers,This study investigated the rate of high-risk 16,18 types HPV infection among 120 patients with colorectal adenocarcinoma and explored relationship of high-risk 16,18 types HPV infection and colorectal adenocarcinoma.Methods  120 patients with primary colorectal adenocarcinoma were enrolled in this study,samples were taken from the tumors in 120 patients and the normal mucosa in 30 normal persons,multi-channels real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(MRFQPCR)was used to detect single type and two types HPV DNA(16,18 types).Results  HPV 16,18 DNA expression was significantly higher in colorectal adenocarcinoma(75.00%,90/120)than that in the normal mucosa (6.67%,2/30),P<0.05,a correlation was found HPV 16,18 DNA expression with tumor location,77.53%(69/89)in the rectal adenocarcinoma ,73.33%(11/15) in the sigmoid colon adenocarcinoma and 62.50%(10/16)in the ascending、transversal,descending colon adenocarcinoma(P<0.05).Conclusion  Our findings indicated that there was a correlation between colorectal adenocarcinoma and HPV 16,18 infection,the rate of HPV 16,18 infection was relatively higher in colorectal adenocarcinoma,the first was HPV 18 infection(33.33%,40/120),the second was HPV 16,18 infection(27/120,22.50%),the third was HPV 16 infection(23/120,19.17%),the infection of HPV 16,18 may play an important role in colorectal adenocarcinoma.
[Key words]  human papillomavirus(HPV); colorectal adenocarcinoma;HPV16,18 types; real-time fluorescent quantitative PCR

    人乳头瘤病毒(human papillomavirus),简称HPV,分为高危型、中危型及低危型,HPV16、18型属于HPV的高危型别,与宫颈癌、肛周癌、口腔癌等肿瘤的发生发展密切相关,随着HPV基因检测设备及试剂的不断改进和优化,其研究逐步深入。由于HPV在结直肠腺癌的发生发展中起着重要的作用,近年来,HPV与结直肠癌的关系已被人们关注和重视。以往文献由于采用的检测方法及试剂的敏感性不同,以致报道的感染率不一,且普遍偏低。本文对30例正常人肠黏膜的石蜡组织标本及120例结直肠腺癌患者的石蜡组织标本,采用目前最敏感的HPV检测技术,即实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ PCR)技术,分组测定120例结直肠腺癌石蜡组织标本中HPV感染的类型及感染率的情况,并进行统计学分析。
1  材料与方法
1.1  材料  本文收集了南京中医药大学第三附属医院全国肛肠医疗中心2009年1月-2010年7月的120例结直肠腺癌检测病例的石蜡组织标本,男72例,女48例,年龄36~86(平均62.51)岁,正常人肠黏膜标本30例,总标本150例,病理诊断由两位经验丰富的病理医师参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范》第3分册《大肠癌》标准复查切片,并复习其临床及病理资料。
1.2  方法
1.2.1  组织DNA的提取  取经石蜡包埋的120例结直肠腺癌的组织标本及30例正常人肠黏膜的组织标本,每次选12份标本,每份标本切取4μm组织10片,放入锥形管中,用1ml二甲苯脱蜡,15min,震荡混匀后,放入高速离心机,12500转/min,离心,去上清液,再加入1ml无水酒精水化,15min,震荡混匀后,12500转/min,离心,去上清液,用蛋白酶K消化( 用160μl蛋白酶K加蒸馏水320μl配成混合液,再把混合液分成12份),每份标本加混合液40μl,37℃温箱消化3h以上备用。
1.2.2   DNA模板的提取  采用上海复星医药科技发展有限公司提供的试剂盒按照说明提取DNA。而后用乙醇沉淀法纯化。纯化后测纯度,得结果是:A260/A280=1.85,A260/A230=1.86
1.2.3  PCR扩增  引物和探针的设计与合成:根据NCBI确定候选目的的基因片段序列,利用GenBank上提供的序列设计引物和探针(由上海复星医药科技发展有限公司合成),引物和探针见表1。

表1  16、18型HPV荧光定量分析中的引物与探针


Prime                       Sequence                                  Probe                            
16型HPV      Up:5’- GCA CAG GGH CAY AAY AA-3’
Down:5’-ACA YAA ATT GYA AWT CAT AT-3’   5’-TGTTACTGTTGTTGATACT-3’
18型HPV      Up:5’- GCA CAG GGH CAY AAY AA-3’
Down:5’-ACA YAA ATT GYA AWT CAT AT-3’         5’-ATTTGTTACTGTGGTAGA-3’
    注:*表1序列中的H可代表A、C、T;Y可代表C、T、U;W可代表A、T

1.2. 4  PCR反应体系  PCR反应体系(总体系30μl)放入福建泰普TL-1890型(三通道)RT-PCR中,见表2。

表2  16、18型HPV PCR反应的步骤、温度、
时间及循环数


步骤    温度    时间    循环数
预反应    50℃    2min    1
预变性    94℃    2min    1
变性    94℃    5s    40
延伸    55℃    30s
    注:(1)升降温速率为5℃/s;(2)在60℃时采集荧光信号,采集;(3)方式设为“SINGLE”

1.3  统计学处理  将120例结直肠腺癌的石蜡组织标本及30例正常人肠黏膜的石蜡组织标本检测得到的HPV感染的三种阳性结果,应用统计软件包SPSS 13.0,采用χ2检验分组进行数据分析。
2  结果
2.1  定性结果判断  见表3。
阳性结果可诊断为HPV感染;阴性结果说明DNA的含量低于检测下限,但并不能排除含有其他型别HPV DNA的可能性。16、18型HPV定性结果判断的标准见表3。
    每次检测均设置阳性校准品,临界阳性校准品和阴性对照品。

表3  16、18型HPV定性结果判断的标准


Ct值      结果判断标准
Ct值无任何数值    为阴性结果 
38≤Ct值<40    检测灰区,重新检测2次   复检2次,Ct值无,为阴性结果
复检2次,其中至少1次Ct值<40,为阳性结果
Ct值<38    为阳性结果 

2.2  结果分析  在120例结直肠腺癌组织中直肠腺癌总的HPV感染率为77.53%(69/89)、乙状结肠腺癌总的HPV感染率为73.33%(11/15)、升、横、降结肠腺癌总的HPV感染率为62.50%(10/16),其中,16、18型HPV 感染27例,其感染率为22.50%(27/120);16型HPV 感染23例,其感染率为19.17%(23/120);18型HPV 感染40例,其感染率为33.33%(40/120),总的HPV感染率为75.00%(90/120)。 结直肠腺癌以18型感染为主,其次为16、18型混合感染,16型感染率最低。单一型别的感染率为52.50%(63/120),而混合型别的感染率为22.50%(27/120), 病例及标本分组及HPV感染情况见表4。直肠腺癌、乙状结肠腺癌和升、横、降结肠腺癌三组之间16、18型HPV DNA阳性率比较差异无显著性(P>0.05),而三组腺癌与正常人结直肠黏膜组织比较,16、18型HPV DNA阳性率均差异有显著性(P<0.05),并提示结直肠腺癌组织中存在着较高的16、18型HPV 感染,其感染与结直肠腺癌发生发展密切相关,癌灶部位距肛门越近,感染率越高。

表4  150例检测标本中HPV DNA阳性例数
和阳性率检测结果  例(%)


病理诊断        例数        总的
HPV        16、18型
HPV        16型
HPV         18型
HPV
直肠腺癌         89         69(78)   22(25)   18(20)   29(33)
乙状结肠腺癌     15         11(73)          4(27)      3(20)   4(27)
升、横、降
结肠腺癌       16         10(63)          1(6)       2(13)    7(44)
正常人
肠黏膜           30          2(7)          1(3)   0(0)   1(3)

 3  讨论
人乳头瘤病毒是一类古老的病毒,它们从远古走来。由于人乳头瘤病毒的特殊性以及研究与诊断方法的滞后性,使得它们姗姗来迟,直到今天人类才揭开它们部分神秘的面纱。现已发现人乳头瘤病毒有200多个型别、亚型及变异体。 又由于人们都把目光主要集中在女性生殖道疾病的人乳头瘤病毒研究上,迄今为止,直肠、肛管及肛门区人乳头瘤病毒感染的专题研究非常少见,全世界尚无确切可靠的结直肠腺癌的16型、18型人乳头瘤病毒感染的分子流行病学的大样本的研究资料。当前人乳头瘤病毒基因检测是捕获人乳头瘤病毒感染的最好的方法,实时荧光定量基因检测是目前所有人乳头瘤病毒基因检测方法中最敏感的一项检测技术。由于所采用的人乳头瘤病毒基因检测方法的不同,使用的探针核酸序列的不同以及标本取样的不同,均可导致其特异性和/或敏感性的不同,以致得出的结果不同。随着人乳头瘤病毒成为肿瘤病因学研究的热点,以往所做的研究,由于检测设备及探针的特异性和/或敏感性不够,其研究结果需要重新评估[1~4,6~8]。本文采用目前最敏感的实时荧光定量基因检测技术对120例结直肠腺癌及30例正常人肠黏膜的石蜡组织标本进行高危型(16型、18型)人乳头瘤病毒的基因研究,以分析此部位高危型人乳头瘤病毒的感染率。
人乳头瘤病毒属乳头瘤病毒科,是一类特异感染人类上皮、黏膜的微小共价双链环状DNA病毒。 它们以闭合超螺旋结构、开放的环状结构、线性分子结构3种形式存在。远古时期,人类就已经意识到人的皮肤疣可能与此病毒感染有关,由于此类病毒的特殊性,再加上当时没有有效的诊断方法,延缓了人类对它们的研究。直到1949年Straus等人首先在电镜下从人皮肤的普通疣体浸出液中观察到人乳头瘤病毒颗粒,这才使得人类首次见到人乳头瘤病毒朦胧而又神秘的身影。人乳头瘤病毒DNA长约8.0kb(8000bp碱基对),分子量为5×106,其中88%是病毒蛋白,沉降系数40,在电镜下观察该病毒为球型、无包膜、表面有72个壳微粒,直径45~55nm。天然的人乳头瘤病毒粒子由360个L1和12个L2组成,72个L1的五聚体模块组成了T=7的二十面体对称结构,一个L2分子与一个L1五聚体相互作用。与其他病毒所不同的是,乳头瘤病毒一开始就采用基因型来分类,一般不用血清型进行表述。人乳头瘤病毒目前仍不能在体外细胞中进行培养[1~3]。
乳头瘤病毒基因组按其功能分为三个编码区:早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和长期控制区(LCR),分别占基因组的50%、40%和10%。早期转录区含有8个开放读码框(open read frame,ORF),早期转录区大约由4500bp组成,包含E1、E2、E3、E4(晚期)、E5、E6、E7、E8七个早期基因,编码8个蛋白,控制病毒转录、复制和转化,晚期转录区L1、L2大约由2500bp组成,分别编码2个晚期蛋白,为主要和次要衣壳蛋白,余下的1000bp构成长期控制区,为非编码区,位于早期区、晚期区之间,含有不同转录受体和激活因子的重叠结合区,控制早期、晚期转录区的转录和病毒颗粒的合成[1~4]。
1976年人们提出人乳头瘤病毒是致癌因子,直到70年代后期,第一株人乳头瘤病毒被克隆入细胞,1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头瘤病毒颗粒,与此同时,Hausen提出人乳头瘤病毒与宫颈癌发病有关的假设,经过大量的研究,1995年IARC专题研讨会认为人乳头瘤病毒感染是宫颈癌的主要病因,由于分子生物学及基因技术的快速发展,80年代又对多种型别的人乳头瘤病毒进行了克隆,并且对病毒的基因结构与功能做了研究,因此,分子生物学技术对揭示该病毒的特征及致癌的分子机制作出了重大的贡献[1]。
HPVE6及E7基因对细胞生长刺激最为重要,它们的蛋白产物能引起宿主细胞的永生化,与病毒的细胞转化功能及致癌性有关,是病毒的主要癌蛋白。一般认为HPV DNA在良性和癌前病变中以游离形式存在,而在恶性肿瘤中往往以单拷贝或多拷贝整合于宿主细胞基因中。整合部分常发生于E1、E2、E4和E5区,这些区域DNA片段可随整合而从病毒基因组中丢失。当E6和E7整合入宿主细胞时,最有可能导致癌变[1]。
人乳头瘤病毒感染一般可分为高危感染、低危感染、一过性感染、延迟性感染及持续性感染几种类型,其中以高危持续性感染最为重要[1,2]。
 2008年诺贝尔生理学或医学奖授予了德国病毒学家哈拉尔德·楚尔·豪森(Hausen)教授。豪森的获奖成就是他发现了人乳头瘤病毒的高危型病毒引起宫颈癌的分子机制,同时也给了我们新的启迪,高危型人乳头瘤病毒不但能致宫颈癌,也能够致人类其他部位的癌。
近年来,研究已发现了HPV与结直肠腺癌相关的证据。我国台湾学者Cheng等[5]在三个中国人大肠腺癌细胞系中发现HPV16型和HPV18型的DNA表达,并通过转基因技术进一步证明了中国人大肠腺癌细胞系与HPV16型有关,以往多数采用免疫组化、核酸杂交、PCR、Southern blot杂交等技术来检测HPV,由于这些方法的敏感性不够及其自身的缺陷,正被操作简便,更敏感的实时荧光定量PCR技术所取代[1,2]。
目前,结直肠癌已跃居癌症排行榜的第二位,结直肠癌是世界第二大癌症死因,同时也是最容易预防和控制的恶性肿瘤之一。一般人一生中发生结直肠腺癌的可能性为6%,每年诊断的各种癌症中有14%发生在结肠或直肠。 结直肠腺癌可发生在各个年龄段,但90%结直肠腺癌都发生在40岁以上的患者,多数患者被诊断时年龄在50~60岁,年龄越大患癌风险越大。
本文结直肠腺癌组织中直肠腺癌总的HPV感染率为77.53%(69/89)、乙状结肠癌总的HPV感染率为73.33%(11/15)、升、横、降结肠癌总的HPV感染率为62.50%(10/16),就16、18型HPV 感染率来说,其感染率与宫颈鳞癌的16、18型HPV 感染率在70%左右相比非常相似,提示16、18型HPV 感染与结直肠腺癌的发生发展密切相关,可能是结直肠腺癌发生的主要因子,本课题组正在进行大样本的研究。在结直肠腺癌组织中存在着16、18型HPV 感染灶,其感染灶部位距肛门越近,感染率越高。又由于本文120例结直肠腺癌中,直肠腺癌89例,占总数的74.17%,乙状结肠癌15例,升、横、降肠癌16例,后两者相加31例,占总数的25.83%,提示结直肠腺癌中直肠腺癌占了一大半,而直肠腺癌中约半数患者肿瘤位于5cm以下,且往往要切除肛门,而影响患者的生活质量,所以说,早期防控结直肠腺癌,尤其是提高直肠腺癌患者的生活质量就显得非常重要。
在120例结直肠腺癌中,16、18型HPV 感染27例,占总数的22.50%;16型HPV 感染23例,占总数的19.17%;18型HPV 感染40例,占总数的33.33%,提示结直肠腺癌组织中16、18型HPV 的感染,以18型HPV 感染为主,其次是16、18型HPV 的混合感染,最后是16型HPV 感染。而宫颈鳞癌中则以16型HPV 感染为主[3,8],这可能是18型HPV对肠道腺上皮有特殊的嗜性,更易感染结直肠腺上皮的缘故。
在结直肠腺癌组织中能检测到较高的HPV DNA,足以说明HPV是结直肠腺癌发生发展的重要病因之一。 本研究采用更敏感的实时荧光定量PCR检测技术,并对国人结直肠腺癌组织中的HPV16、18型DNA序列进行检测,其结果总的阳性率为75.00%(90/120),而在正常肠黏膜组织中只检测到1例HPV16、18型和1例18型DNA,支持HPV16、18型感染与结直肠腺癌发生发展密切相关的观点。但本研究检出的HPV16、18型DNA阳性率比以往文献[6]报道结果要高,其原因可能为:(1)HPV16、18型感染可能存在着地区性分布。我国是HPV感染的高发区,且主要感染型别为HPV16、18型,结直肠腺癌,则以18型HPV 感染为主;(2)选择的检测方法的不同。目前,实时荧光定量PCR检测技术是HPV基因检测技术中一项最敏感的检测技术,此技术比免疫组化、单用核酸杂交或PCR技术检测HPV DNA具有更高的敏感性[1,2];(3)选择的引物或探针不同。HPV16、18型DNA常整合于癌细胞DNA中,整合后只保留E6、E7基因,而其余早期和晚期基因大部分会丢失。 故选择E6、E7以外的早期或晚期基因为引物或探针检测肿瘤组织中的HPV DNA,阳性率可能会较低或甚至出现阴性结果[1,2];(4)本研究中HPV16、18型感染阴性的结直肠腺癌组织中很可能存在其他型别的感染,下一步除继续对结直肠腺癌组织中HPV16、18型感染进行大样本的研究外,并对HPV16、18型感染阴性的结直肠腺癌组织进行其他型别的HPV感染的基因研究;(5)在40岁以上的人群中开展高危型HPV的研究以及肛门直肠的细胞学检查,这将对结直肠腺癌的防控具有非常重要的意义[9~11]。

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(本文编辑:文 娴)

作者: 龙秀荣1,耿建祥2Δ,樊志明2▲,陈建宁2,周 伟2, 2011-6-29
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