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【摘要】 目的 研究扎来普隆舌下喷雾剂在比格犬体内相对生物利用度。方法 采用随机交叉试验设计，6条健康比格犬分别给舌下喷雾剂和分散片两种制剂各10mg，反相高效液相色谱法测定血浆中扎来普隆的浓度。结果 比格犬在服用舌下喷雾剂和口腔分散片后扎来普隆的Cmax分别为（133.7 ± 55.5）μg/L和（207.5 ± 53.1） μg/L。tmax分别为（31±9.2）min 和（58.3 ± 34.9） min，t1/2分别为（33.7±18.6）min和（31.2 ± 15.2） min，AUCo-6h分别为（12340.6 ± 6702.7）μg/（min·L）和（16303.7 ± 3638.1） μg/（min·L）。AUC0-∞分别为（16390.4 ± 14498）μg/（min·L）和 （16906.8 ± 4347.3） μg/（min·L）。扎来普隆舌下喷雾剂相对于分散片的生物利用度为（96.9 ± 15.2）%。结论 两制剂的各药动学参数间差异均无显著性（P>0.05），经双单侧t检验证实，两制剂具有生物等效性。
【关键词】 扎来普隆；舌下喷雾剂；生物利用度；比格犬；反相高效液相色谱法
Relative bioavailability of zaleplon by sublingual spray in health Beagle dog
WANG Hui-tao, GUO Yan-fang, GAO Yong-liang, et al.Department of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
【Abstract】 Objective To study the relative bioavailability of zaleplon by sublingual spray in healthy beagle dogs. Methods In a randomized crossover study, 6 healthy beagle dogs were given a dose of 10 mg zaleplon by sublingual spray or dispersible tablets. Zaleplon concentration in plasma was determined by a RP-HPLC. Results After administration of sublingual spray and dispersible tablets, the pharmacokinetic parameters as followed: Cmax were （133.7 ± 55.5）μg/L and （207.5 ± 53.1） μg/L, tmax were （31 ± 9.2）min and （58.3 ± 34.9） min，t1/2 were （33.7 ± 18.6）min and （31.2 ± 15.2） min, AUCo-6h were （12340.6 ± 6702.7）μg/（min·L） and （16303.7 ± 3638.1） μg/（min·L）, AUC0-∞ were （16390.4 ± 14498） μg/（min·L） and （16906.8 ± 4347.3） μg/（min·L） respectively. The relative bioavailability of sublingual spray was （96.9±15.2） %, comparing with that of dispersible tablets. Conclusion There is no significant difference in pharmacokinetic parameters between the two preparations. It is demonstrated that the two preparations are bioequivalent by two one-side t tests.
【Key words】 zaleplon; sublingual spray; bioavailability; Beagle dog; reversed phrase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）
扎来普隆（zaleplon，商品名sonata）为美国Wyeth Ayerst Laboratories Inc．研制的新型非苯二氮艹 卓类催眠药，具有镇静催眠、肌肉松弛、抗焦虑和抗惊厥作用［1］ 。美国FDA于1999年8月批准该药上市，用于成年人失眠的短期治疗［2］。扎来普隆可选择性地结合I型苯二氮艹 卓类（omega.1）受体亚族，与唑吡坦的作用机制相似，其特点是起效快，半衰期短，无宿醉现象，因而受到患者欢迎。本试验以扎来普隆分散片为参比制剂，研究了扎来普隆舌下喷雾剂的比格犬体内相对生物利用度［3］，为临床合理用药提供科学依据。
1 仪器与试药
LC-10AT高效液相色谱仪（日本岛津），包括LC-10AT泵，SPD-10A检测器，N2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程有限公司）；涡旋振荡器：QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；离心机：Anke TDL-40B centrifuge；参比制剂：扎来普隆分散片（规格5mg 批号20060504）；受试制剂：扎来普隆舌下喷雾剂；内标：艾司唑仑（estazolam），湖北制药厂，批号2001 1003M）；乙腈-甲醇为色谱纯。比格犬，雌雄各半，体重8～10kg，由北京科宇提供。
2 方法
2.1 色谱条件 流动相：乙腈-甲醇-水（50：55：95）；流速：0.8 ml/min；检测波长：230nm；色谱柱：Agilent EclipsexDB C8（4.6mm×150mm,5μm）；柱温：30 ℃。
2.2 血浆样品萃取剂的选择与优化 分别制备含扎来普隆 100ng/ml的血浆样品，取0.5 ml于尖嘴玻璃试管中，分别加入3ml乙醚、乙酸乙酯，体积比1:1和1:2比例的乙醚和正己烷的混合液蜗旋3 min，3000 rpm离心10 min，取上清液，N2吹干，50μl流动相复溶，进样，20μl定量环定量。比较经两种方法处理后的含药血浆的色谱图，以确定萃取剂。
2.3 方法专属性 分别取比格犬空白血浆，空白血浆外加扎来普隆标准品和内标，以及扎来普隆舌下给药后30min的血浆样品加内标各50μl按上述方法操作，记录HPLC色谱图，考察扎来普隆与狗血浆中内源性杂质的分离情况。
2.4 标准曲线和线性范围 取比格犬空白血浆0.5ml，分别加含内标的扎来普隆系列标准溶液50μl，配制成相当于浓度分别为10、20、50、100、200ng/ml的血浆样品，按血浆样品处理项下依法操作，建立标准曲线。以血浆样品中扎来普隆与内标色谱峰面积的比值为横坐标，以血浆样品中扎来普隆浓度为纵坐标，进行回归运算，求得直线的回归方程并绘制标准曲线。
2.5 精密度 取比格犬空白血浆0.5ml，分别加含内标的扎来普隆系列标准溶液50 μl，配制低、中、高3个浓度（分别为20、100、200ng/ml）的质量控制（QC）样品各5份，进样测定，连续测定3天，以扎来普隆峰面积与内标峰面积比值计算日内和日间标准差。
2.6 准确度 取比格犬空白血浆0.5 ml，分别加含内标200ng/ml的扎来普隆系列标准溶液50 μl，配制低、中、高3个浓度（分别为20、100、200ng/ml）的质量控制（QC）样品，每一浓度进行5样本分析，将所得色谱峰面积分别与扎来普隆低、中、高3个浓度的标准溶液的色谱峰面积比较，考察样品的绝对回收率（%）；另将所得色谱峰面积比分别代入血浆标准曲线，计算测得药物浓度，与加入量比较，考察样品的相对回收率（%）。
2.7 最低定量限 根据标准曲线制备时扎来普隆为10 ng/ml的5份样品的峰面积，计算其RSD值，确定最低定量限。
2.8 比格犬体内药动学试验 6只比格犬随机分为两组，禁食12h于清晨空腹口服扎来普隆分散片2片（相当于扎来普隆10 mg）或扎来普隆舌下喷雾剂4喷（相当于扎来普隆10mg），采血期间不得离开，避免剧烈运动。清洗1周后，交叉给药。并于服药前（0 min）和服药后10、20、30、45、60、75、90、120、150、180、240、360、480 min分别从股静脉取血5ml，放置后3000rpm 离心10 min，取上层血清放置于-4℃冰箱中冷冻保存，以供测定用。
3 结果
3.1 血浆样品处理 比较经乙醚、乙酸乙酯、乙醚：正己烷（1:1）、乙醚：正己烷（2:1）四种萃取剂处理后的比格犬空白血浆的HPLC色谱图见Fig.1。结果表明乙醚：正己烷（2:1）萃取后样品峰分离良好，没有干扰，而其余萃取剂萃取后，扎来普隆与内源性杂质分离较差。因此，最后选择乙醚:正己烷（2:1）作为含药血浆扎来普隆的萃取剂。
最终确定血浆样品处理过程如下：取血浆0.5ml至于10ml的尖嘴玻璃离心管中，加入内标50μl（2μg/ml），蜗旋混匀，加乙醚：正己烷（2:1），蜗旋3min，3000rpm离心10min。取上层有机相2.4 ml，置于已加了30 μl饱和羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）水溶液的玻璃试管中，45℃水浴，N2吹至只剩下水层。45℃真空干燥，50μl流动相复溶，蜗旋使充分溶解，进样，20μl定量环定量。
3.2 方法专属性 比格犬空白血浆、空白血浆外加扎来普隆标准品及比格犬给药后血浆样品的色谱图见Fig.2。A Acetic ether as extraction solution ;B Ether as extraction solution;C Ether:n-hexane （1:1） as extraction solution; D Ether: n-hexane （2:1）as extraction solution
Fig.1 HPLC chromatograms of zaleplon and internal standard in blank plasma1 zaleplon,2 internal standard；A Blank plasma;B zaleplon and internal standard（IS） in blank plasma; C Dog plasma 30min after administrate of zaleplon at doses of 10mg and spiked with IS solution
Fig.2 Chromatograms of zaleplon in plasma 结果表明，比格犬血浆中内源性物质对扎来普隆测定不产生干扰，该方法专属性良好。
3.3 标准曲线和线性范围 扎来普隆与内标峰面积比R（R= AT／AIS）对扎来普隆血浆药物浓度的直线回归方程为Y=118.3R-6.291 r2=0.999（n=3），本法在10～200ng/ml线性范围良好，标准曲线见Fig.3。 Fig.3 Calibration curve3.4 精密度 扎来普隆比格犬血浆样品的日内日间精密度结果如 由上结果可见，该方法的精密度符合生物样品测定的精密度要求。
3.5 准确度 扎来普隆比格犬血浆样品的回收率试验结果见Tab.2。Tab.2 Recovery of zaleplon in dog plasma
3.6 最低定量限 标准曲线制备时扎来普隆为10的5份样品的色谱峰面积比分别为0.11、0.11、0.13、0.12、0.15，RSD值为13.5%，符合生物样品测定的精密度要求，所以该方法的最低定量限为10 ng，色谱图见Fig.4。
3.7 数据处理 药动学参数 tmax、Cmax取实测值；以消除相LnC-t直线回归斜率k计算t1/2，t1/2=0.693/k；以梯形法计算AUC0-t ，AUCt-∞=C/k，AUC0-∞=AUC0-t+ AUCt-∞。相对生物利用度由受试制剂和参比制剂的AUC0-t比较而得；生物等效性评价:tmax以Wilcoxon方法检验，Cmax、AUC0-t、AUCt-∞先进行对数转换，再做方差分析和双单侧t检验，在α=0.05时差异无显著性，受试制剂和参比制剂生物等效，扎来普隆的主要药动学参数见表Tab.3，曲线见Fig.5。 1 zaleplon; 2 internal standard
4 讨论与结论
血浆中扎来普隆的测定方法，国内外均有高效液相荧光检测法、HPLC-MS的报道，本文采用高效液相色谱法，用内标法定量，最低定量限可达10ng/ml。采用230nm为检测波长，血浆内源性干扰较少，方法专属性较好。实验过程中，在吹干时，药物容易贴在试管壁上，直接用流动相复溶后，所测的数据不稳定，重复性差，考虑过用正己烷反萃、超声复溶，效果均不太理想，由于羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）在片剂中用作崩解剂，故在复溶前加入HP-β-CD，解决了药物贴壁难于复溶的问题，使药物能够完全溶于流动相，提高方法的重复性。实验数据表明，该法灵敏度高，操作简单、准确，能够用于扎来普隆的比格犬血浆药物浓度检测，适用于扎来普隆体内药物动力学研究。
两制剂的Cmax和AUC经方差分析和双单侧t检验表明扎来普隆舌下喷雾剂与分散片具有生物等效性。扎来普隆舌下喷雾剂具有服用方便，适合老年人和吞服困难的患者。
【参考文献】
1 朱珠．催眠新药扎来普隆．中国药学杂志，2000，35（1）：63-64．
2 Bharathi Ch, Prabahar K3。J, Prasad Ch, S. Impurity profile study of zaleplon. Pharm Biomed Anal, 2007,44（1）,101-109.
3 邓鸣，刘建芳，刘会臣. 扎来普隆分散片的人体相对生物利用度.中国医院药学杂志，2004,24（7）:402-404.
作者单位：030001 山西太原，山西医科大学药学院临床药学研究室（△通讯作者）