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【摘要】 目的 建立RP-HPLC对葛根芩连片中黄芩苷含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(Stable Bond Analytical 4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸水(50：50)，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长280nm。结果 操作简单，结果准确，平均回收率为96.48%。结论 本法操作简便、准确、重现性好，可用于葛根芩连片中黄芩苷含量的测定方法。
【关键词】 葛根芩连片;黄芩苷;RP-HPLC
Objective To set up a method for determining the content of baicalin in Gegen Qinlian Tablets with HPLC.Methods Chromatography was performed on a Agilent ZORBAX SB-C18(Stable Bond Analytical 4.6×250mm，5μm),with a mixture of methanol-0.2% phosphoric acid(50:50) as the mobile phase.The detection wavelength was 280nm ,and the column temperature was maintaned at 30℃,and the flow rate was 1.0ml/min.Results The mean value of recovery rate is 96.48%.Conclusion This methed was shown to be simple, accurate, with a good reproducibility and could therefore be used for the quality control for Gegen Qinlian Tablets.
[Key words] Gegen Qinlian Tablets;Baicalin;RP-HPLC
葛根芩连片是由葛根、黄芩、黄连、炙甘草四味中药材组成的中成药制剂，具有解肌清热、止泻止痢的功效，用于湿热蕴结所致的泄泻、痢疾等症[1]。其中黄芩为该中成药中的君药，故在质量控制时选用测量黄芩中主要有效成分黄芩苷的含量。本文采用HPLC方法对葛根芩连片中的黄芩苷进行了含量测定，获得较为满意的效果，并结合PDA检测器对样品中黄芩苷色谱峰的光谱纯度进行了有效的定性。
1 实验部分
1.1 仪器
Waters 2695高效液相色谱仪(Waters2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站)，超声波清洗器(KQ2200DB，40kHz，80W，上海新苗医疗器械制造有限公司);混合纤维素酯微孔滤膜(孔径：0.45μm)，电子分析天平(Sartorius BS 224 S), SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。
1.2 试剂与材料
甲醇(色谱纯，20070315112)，乙醇(分析纯，20070827093)，黄芩苷对照品由中国药品生物制品鉴定所提供(批号110715-200212，供含量测定使用)，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。葛根芩连片(河南禹州市药王制药有限公司，批号分别为081005、081010、081012)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性考察
Agilent ZORBAX SB-C18 (Stable Bond Analytical 4.6×250mm，5μm)色谱柱;流动相：甲醇-0.2%磷酸水(50：50)，流速：1ml /min，柱温30℃，检测波长280nm，在此色谱条件下，理论塔板数大于7000，分离度大于1.5，进样量为10μl。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品适量，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.483mg/ml的黄芩苷对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取供试品10片，研细，混匀，精密称取相当于平均每片的样品重量，置50ml容量瓶中，精密加入70%乙醇50ml，摇匀，称定重量，超声处理(功率200W，频率50Hz)30min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。以上所配溶液的HPLC色谱图见图1。图1 样品HPLC色谱图
黄芩苷对照品(A)、供试品(B)及阴性样品、(C)HPLC色谱图
光谱纯度分析及样品中黄芩苷色谱峰定位分析：选择与黄芩苷对照品相对应的色谱峰进行光学纯度分析，以保证此色谱峰的光谱纯度较高，没有共流物的出现。
PDA光谱纯度分析设定波长为210～400nm全波段扫描。由以上四个光谱纯度分析图上可以看出：在供试品11.050min的色谱峰位置与黄芩苷对照品光谱有较大相似，如图2、图3;将两者光谱重叠得到PDA光谱区别图(如图4)，由图4中可以看出，区别曲线在0.000范围内波动较小，并且由PDA数据校正产生纯度与阈值角度上来看 (如图5) ，PDA光谱匹配角度为0.678，PDA匹配的阈值角度为1.272，光谱匹配角度<匹配的阈值角度，说明该色谱由较高光谱纯度;由PDA光谱纯度分析图中可以看出，自动阈值角度>色谱纯度角，说明该色谱峰的光谱纯度较高，没有光谱共流物的出现，可以作为样品中黄芩苷进行定量分析。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下的黄芩苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件进样，记录色谱，以峰面积为纵坐标，以黄芩苷浓度为横坐标进行回归计算，得线性回归方程为Y=2.82×104X～9.24×104，r =0.9998(n=5),结果表明在19.32～96.60μg/ml范围内与黄芩苷的峰面积呈良好的线性关系。图2 黄芩苷对照品PDA光谱图图3 供试品在11.050min色谱的光谱图图4 对照品与供试品PDA光谱区别图图5 PDA光谱纯度分析图
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl，重复进样5次，并进行测定，测定其RSD为0.75%，表明精密度良好。
2.6 稳定性试验
按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，立即进样，分别于0、4、8、16、24、48、72h进样，测定其RSD值为0.83%(n=6)，结果表明，供试品溶液在48h内稳定性良好。
2.7 重复性试验
按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，制备5份供试液，精密吸取供试品溶液10μl，并进行测定，RSD为0.91%(n=5)，说明供试品溶液的重复性良好。
2.8 加样回收试验
取葛根芩连片(批号 081012)10片，按照“2.3”项下制备供试品溶液，制备同时加入适量对照品溶液，用70%乙醇稀释至刻度，再取0.5ml此溶液至10ml容量瓶中，加入甲醇定容，进行测定，记录色谱，计算其RSD=0.62%(n=6)，其结果见表1。 表1 加样回收率实验
2.9 黄芩苷的含量测定
取3个不同批号的葛根芩连片按“2.3”项下制备供试品溶液，分别进样10μl，测定(n=3)，取三次测定平均值，结果见表2。
3 讨论
3.1 2010版
《药典》对黄芩供试品制备采用回流提取，本实验供试品制备采用超声提取方法，采用3批葛根芩连片分别制备供试品，结果显示黄芩苷含量符合药典要求，超声提取方便、节约时间，提取效率高，适合于黄芩样品供试品的制备。表2 3批样品的含量测定结果
3.2 检测波长的确定
经过检测器在200～400nm波长段扫描紫外吸收光谱图，发现黄芩苷在280nm和317nm处有两个吸收峰，由于在280nm处为最大特征吸收峰，因此选择280nm处为黄芩苷的测定波长。
3.3 流动相的选择
实验曾选用甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)、甲醇-0.2%磷酸水(50：50)、乙腈-0.02%磷酸(47:53)为流动相，经实验比较，选用甲醇-0.2%磷酸水(50：50)为流动相，色谱分离较好，理论塔板数较高，达到色谱系统性要求。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中国药典，2005年版一部.北京：化学工业出版社，2005: 211-212.
2 温华珍,肖盛元,王义明,等.黄芩化学成分及炮制学研究.天然产物研究与开发, 2004, 16(6): 575-580.