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Construction of vectors expressing recombinant hepatitis B virus surface antigen including preS and expression in CHO cell
Yan Hua，Chen Kejin，Quan Jiawu，et al.
Wuhan Institute of Biological Products，Hubi430060.
【Abstract】 Objective To construct eukaryotic vectors that express recombinant HBV S antigen carrying preS and to detect their expression in CHO cells.Methods To construct S and preS fusion gene by overlapping-PCR.These genes were inserted into different eukaryotic expression vectors respectively.These vectors were co-transfected into CHO/dhfr-cell.The supernatant of cultured cell was assayed by ELISA and RHHA.Results The supernatant exhibited S and preS antigenicity.Con
clusion The construction of HBV S antigen carrying preS eukaryotic expresˉsion vectors and their expression in CHO/dhfr-cell is successful.
Key words hepatitis B virus surface antigen PreS gene CHO/dhfr-cell
乙型肝炎病毒携带者占中国总人口的10%左右，其所导致的乙型肝炎在中国已成为非常严重的传染性疾病，控制该疾病的主要手段是通过乙肝疫苗预防接种。当今在中国使用的乙肝疫苗是利用基因工程技术表达的乙肝病毒表面主蛋白—S抗原，但是以该疫苗免疫的人群中有大约10%的被免疫人群低应答或无应答。现在研究发现用带前S的乙肝表面抗原免疫原低应答和无应答人群，较大部分免疫者可以产生应答 ［1，2］ 。本课题研究以构建表达带pre S的表面抗原的质粒，并在真核细胞CHO中表达该抗原为目的，为进一步研制新型乙肝病毒疫苗提供了基础 ［3］ 。
1 材料及方法
1.1 质粒、菌株及细胞
菌株E.coli JM109和含乙肝病毒全基因质粒pADR4由本所保存;质粒pcDNA3和pSV2购自Invitrogen公司;CHO/dhfr-细胞购自ATCC公司（由兰州生物制品研究所惠赠）。
1.2 酶和试剂
限制性内切酶Hind III、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶和磷酸酶购自TaKaRa公司和MBI公司;乙肝表面抗原诊断试剂盒和乙肝表面抗原反向血凝试剂购自上海科华公司;乙肝表面preS1抗原酶免检测试剂盒购自上海复星长征公司;乙肝表面preS2抗原酶免检测试剂盒购自北京医科大肝炎试剂中心;DMEM/F12和DMEM购自Invitrogen公司;G418购自Roche公司;氨甲蝶呤购自SIGMA公司。
1.3 扩增pre S和S基因及重组基因的构建
1.3.1 基因的扩增
用PCR方法，以包括乙型肝炎病毒HBV全基因组的pd4-1质粒为模板，以S基因上游引物SA5:5’-GGGTCAAGCTTTGGATGTGTCTGCGG-3’S基因下游引物SB3:5’-CGAGCCGCCACCGCCCGAGCCACCGCC TCˉCACTCAAGATGTTGTA-3’扩增S基因;以pre S1上游引物PB5:5’-GGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCAATCTTTCTˉGTTCCCAAT-3’;pre S1下游引物PC3:5’-GGGTGAˉCAAGCTTTCATTATGGGGTGAACCCTGG-3’扩增preS1基因;以pre S1和pre S2上游引物PB5和下游引物PPC3:5’-GGGTGACAAGCTTTCATTAGAAGTTGACGATAT-3’扩增全preS基因 ［4，5］ 。扩增条件:于94℃预变性5min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
1.3.2 基因的连接
以扩增所得的S基因和pre S1基因为模板，以上游引物SA5和下游引物PC3，PCR扩增获得融合基因SP（含S和preS1基因）;以扩增所得的S基因和全preS基因为模板，以上游引物SA5和下游引物PPC3，PCR扩增获得融合基因SPP（含S和全preS基因），同上步条件扩增 ［4，5］ 。PCR产物加等体积酚:氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。
1.4 重组质粒的构建
分别以限制性内切酶Hind III酶切PCR产物SP和SPP片段，以低熔点纯化回收。同时Hind III酶切质粒pcDNA3和pSV2并以磷酸酶去磷酸化，分别与SP和SPP片段连接后，转化感受态E.coli JM109，挑取阳性克隆，酶切检测，并进行序列测定，选取正向克隆序列的质粒 ［4］ 。
1.5 转染CHO细胞
依据使用说明采用Bio-Q公司的“Gene-shuttle”脂质体转染试剂盒，以pcHBSP和psHBSP为一组及pcHBSPP和psHBSPP为另一组分别共转染CHO/dhfr-细胞，转染后换选择性培养液DMEM（含10%胎牛血清、100mM氨甲蝶呤和500μg/mlG-418），每4天换液1次，同时收集上清液检测 ［4］ 。
1.6 表达产物乙肝表面抗原检测
按使用说明，用乙肝表面抗原反向被动血凝实验检测培养上清液中乙肝表面抗原。
1.7 表达产物酶联免疫检测分析
检测培养上清液分别 用检测乙肝病毒表面抗原、乙肝病毒preS1抗原和乙肝病 毒preS2抗原检测试剂盒进行ELISA夹心法检测其相关抗原 ［5］ 。
2 结果
2.1 表达质粒的构建
分别以含乙肝病毒全基因组的pd4质粒为模板，采用PCR的方法扩增S、preS1（P1）和preS1S2（P1P2）基因，S基因3’引物与preS和preS1S2基因5’引物有15个碱基重叠，以S基因5’引物与preS和preS1S2基因3’引物二次PCR扩增，分别获得新的融合基因650bp左右的SP和1000bp左右的SPP融合基因由两端引物引入HindⅢ酶切位点，以HindⅢ酶切融合基因和表达质粒pcDNA3和pSV2，经连接得到质粒pcHBSP、pcHBSPP、psHBSP、psHBSPP。（见图1）酶切鉴定（图2），并以融合基因的两端的引物双向测定其序列，与预期序列完全相符。
图1 略
图2 略
2.2 转染真核细胞CHO/dhfr-
分别以pcHBSP和psHBˉSP及pcHBSPP和psHBSPP为两组各两质粒共转染CHO细胞，转染后的培养液不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并加G418 和氨甲蝶呤（MTX），只有同时转染两个质粒的细胞（含有 neo和dhfr基因）才能存活。每4天换液并收集上清液。2周后，胰酶消化，细胞记数，进行亚克隆。所能成活并能表达相关抗原的细胞株既为被转染成功的细胞株。
2.3 表达产物反向被动血凝实验检测
用乙肝表面抗原反向被动血凝实验检测培养上清液中乙肝表面抗原，转染后8天可检测到乙肝表面抗原，12天后表达量可达到1:16至1:64。
2.4 表达产物的ELISA分析
按照试剂盒使用说明方法，采用ELISA夹心法检测上清液的S抗原性、preS1抗原性和preS2抗原性（表1），均大于阴性对照的临界值（Cut off of value）。
表1 细胞上清抗原测定略
3 讨论
乙型肝炎病毒自然表达的表面抗原分别是由S基因表达的S、preS2S基因表达的M和preS1S2S基因表达的L三种蛋白组成。现在广泛使用的基因工程乙肝疫苗主要以S蛋白作为免疫用抗原，存在着对部分人群的低应答和无应答的缺点，本研究构建表达的融合蛋白是完整表面抗原，该抗原可能克服了现有乙肝疫苗的部分缺陷 ［3］ 。
为使表达的融合蛋白中两个肽段互相不干扰，并有天然的特性，我们在引物设计时在两个肽段加入了一条柔性短肽，其氨基酸序列为（GGGGS） ˇ 3模式 ［6］ 。对融合蛋白SS1中羧基端前S1抗原主要选取preS1（21-47aa）区域35aa ［2］ ，含有B细胞和T细胞抗原决定簇，及乙肝病毒与肝细胞结合位点 ［7］ ，同时也使表达蛋白尽可能小，有可能使表达量提高。融合蛋白SS1S2基本上包含preS1和preS2区段中所有的敏感位点 ［2］ ，为使表达产物具有所有的乙肝表面抗原免疫原性。通过检测表明表达产物均具有该抗原分子天然免疫
原性，说明实验设计是可行并有效的。
为了能稳定高效地表达融合蛋白，我们采用了两个高效真核细胞表达载体，表达同一融合蛋白的表达质粒，并共转染CHO/dhfr-它们分别具有CMV和SV40启动子，并采用BGH和SV40晚期poly（A）信号，保证目的基因有效地表达。两种质粒分别以新霉素磷酸转移酶（Neo）基因和二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，这便于转染细胞株的筛选，并且可用氨甲蝶呤（MTX）加压筛选，以获得稳定高表达的细胞株。
不同表达系统与表达产物的糖基化程度和免疫原性密 切相关，血源乙肝表面抗原和CHO表达的抗原糖基化程度和抗原表位密度更为接近，我们采用CHO表达系统，所获得的乙肝表面抗原可能有更良好的免疫效果。
总之，我们利用CHO表达系统表达了两种重组乙肝表面抗原，经检测表达产物具有良好的天然免疫原性，表明有良好的应用前景。以后将进行细胞亚克隆化，并以MTX加压筛选，以获得高表达稳定的细胞株，为进行放大规模培养做准备。
参考文献
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作者单位:430060武汉生物制品研究所