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The effect of monocyte chemotactic protein-1on the bladder
tumour infiltrating lymphocytes
Li Dujian，Chen Yirong，Wang Zhiping，et al.
Deparment of Urology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu610041.
【Abstract】 Objective To study the effect of monocyte chemotactic protein（MCP-1）on the proliferation of tumour infiltrating lymphocytes（TILs）in patients with transitional cell cancer of bladder and their cytolysis to bladder tumor.To identify further the antitumor effect of MCP-1with nude mice treatment experiment.Methods TIL cell proliferation was assayed in the presence ofMCP-1by cell counting.Bladder caner cell line EJ was cultured as target cell and cytotoxicity of TIL with different concentration MCP-1（0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml）were determined by3-（3，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bronide（MTT）asaay.The nude mice were injected in the axilla with2.6×16 6 /ml EJ cells suspended in0.1ml of normal salt solution（NS）.The inoculation was successed after4weeks.The mice bearing tumor were randomly dividedinto4groups.Different concentration MCP-1（0.1ng/ml，0.5ng/ml，5ng/ml）were injeced via peritoneal cavity for11consecutive days.Results The proliferation of TIL induced by recombinant interleukin-2（IL-2）was significantly strengthed by MCP-1in a concentration-depenˉdent manner and the cytoxicity was increased to28.3%at concentration of lng/ml compared with control in14days.（P<0.01）.Compared with controls，between two groups’there was significant difference in tumor volume and tumor weight the inhibited rate of tumor volume in two groups were48%，40%respectivety after injection of0.2ml MCP-1with0.5ng/ml，and that of tumor weight were50%，42%respectively after injection of0.2ml MCP-1with5ng/ml.The quantity monocyte of tumor were signific
ant increased in two treatment groups compared with control group（P<0.01）.Conclusion The proliferation and cytoxicity of TILwas increased byMCP-1in a certain concentration.In nude mice experiment，the growth of tumor was inhibited by MCP-1in a certain concentration.Enhancement of the quantity and killing ability of monocyte may be involved in this mechanism.
Key words monocyte chemotactic protein-1 cellular proliferation cytotoxicity mice bladder cancer
膀胱移行细胞癌是泌尿外科的常见肿瘤，其早期经过电切及卡介苗灌注可以起到良好效果，但仍有20%～30%的复发率，且有较多副作用。中晚期肿瘤的手术治疗及免疫治疗患者预后均不理想。本研究旨在观察不同浓度的单核细胞趋化因子（MCP-1）在不同时间对膀胱肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）细胞增殖以及对膀胱肿瘤细胞株（EJ）杀伤作用的影响，裸鼠动物实验对MCP-1的抗瘤机制则进一步探讨。为提高膀胱肿瘤的免疫治疗提供依据。
1 材料和方法
1.1 临床资料
15例膀胱移行细胞癌患者均经病理诊断。男11例，女4例，年龄45～76岁，平均60.5岁。病理分级:Ⅰ级5例，Ⅱ级8例，Ⅲ级2例。临床分期:T 1 7例，T 2 6例，T 3 2例，原发10例，复发5例。
1.2 细胞培养条件
EJ在含15%胎牛血清200mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素100U/ml，链霉素100U/ml的RPMI1640液，5%CO 2 和95%空气的37℃饱和湿度条件下无菌培养，常规方法进行传代。
1.3 TIL的制备及培养
参照改良的Rosenberg法 ［1］ 制备，将淋巴细胞悬液用15%FCS-1640培养液调整细胞数至1.0×10 6 /ml，置于37℃5%CO 2 及含IL-2（1000U/ml）1640培养液中培养。TIL悬液用计数板计出悬液的细胞数量。均用数量/ml表示。MCP-1浓度分别为0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml加入到TIL细胞中，刺激细胞增殖。
1.4 MTTI法测定不同浓度MCP-1对TIL细胞毒性的影响
MTT法参照Sargent等 ［2］ 描述的MTT法并加以改良，用含15%FCS的RPMI1640培养液常规方法进行细胞传代培养。当EJ细胞生长状态稳定，呈对数生长期底面长满时，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化细胞，用培养液将消化下来的细胞重新悬浮成单细胞悬液，计数并调整浓度。EJ细胞以5×10 4 /ml的终浓度接种于96孔板，每孔100μl，在含5%CO 2 的37℃饱和湿度条件下孵育24h后，然后用由不同浓度MCP-1作用15天的TIL（MCP-1浓度分别为0.1 ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，0ng/ml）加于EJ细胞，效靶比为2:1，10:1，50:1，设3个复孔。每孔加入15μl MTT浓度为0.1%，继续孵育4h，1000rpm离心10min，弃上清加入DMSO150μl及20μl甘油酸缓冲液，强震荡10min，静置20min，在酶标仪测各组在570nm处吸光值，计算每组平均值，实验重复3次。细胞抑制率（%）=（1-实验孔/对照孔）×100%
1.5 裸鼠动物实验
20只BALB/c nu/nu裸鼠，体重15～20g，雌性，年龄4～6周，由甘肃省肿瘤医院提供。用含15%FCS的RPMI-1640培养基常规方法进行EJ细胞传代培养，当细胞生长状态良好，呈对数生长期时，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化细胞，并用吸管吹打，用培养液将消化下来的细胞重新悬浮成单细胞悬液，计数后，1000rpm离心10min后，弃上清液，随后放入适量生理盐水，吹打，调整细胞浓度为2.6×10 6 /ml。于每只裸鼠右腋窝皮下注射0.1 ml细胞悬液。21～28天后20只裸鼠接种瘤株成功 ［3］ ，瘤体直径≥0.5cm，将20只裸鼠随机分成4组（每组5只）。
1.6 用药过程
MCP-1浓度:0.1ng/ml，0.5ng/ml，5ng/ml。分对照组:裸鼠5只，腹腔注射NS0.2ml，每天1次，共11次。用药组:裸鼠15只，每组5只，腹腔分别注射不同浓度的MCP-10.2ml，每天1次，共11次。停药2周后处死小鼠，解剖出肿瘤，测小鼠瘤体体积，称重量。
计算公式:V=π/6（a 2 ×b）
V:肿瘤体积a:肿瘤短径b:肿瘤长径
肿瘤体积抑制率（%）=（1-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积）×100%。
肿瘤重量抑制率（%）=（1-实验组肿瘤重量/对照组肿瘤重量）×100%
1.7 在光镜下观察各组裸鼠病理切片单核细胞密度
染 色:苏木素-伊红染色（H.E染色）计数:一张病理切片连续10个高倍视野（400×）单核细胞计数。
1.8 统计学处理
实验结果取3次实验的均值，标准差均小于5%。SPSS8.0统计软件。方差分析、X 2 检验、t检验。
2 结果
2.1 细胞生长曲线及增殖时间
见图1。从图1中可以看出，从膀胱肿瘤标本中分离的TIL第1周，在不同浓度MCP-1的作用下，生长速度缓慢，增殖能力低下（P>0.05）。7天后，TIL开始增殖，至15天达到高峰，扩增明显。当MCP-1为1ng/ml时，扩增密度最为显著（P<0.01）。
图1 不同浓度MCP-1对TIL增殖的作用略
2.2 不同浓度MCP-1诱导TIL细胞毒活性的变化
从表1中可以看到，当MCP-1浓度为1ng/ml时，A 570nm 值最小，当效/靶比为50:1时，细胞抑制率达到28.2%，与未加MCP-1的TIL相比较，杀伤率增加16.4%（P<0.01）。
表1 不同浓度MCP-1作用下TIL的细胞抑制率 （略）
2.3 实验中20只裸鼠均荷瘤成功，无1例死亡，出瘤率100%
从表2、表3可以看到，当MCP-1浓度为0.5ng/ml与5ng/ml，腹腔连续注射11天，用药肿瘤体积明显较对照组小，肿瘤重量抑制率分别为40%与42%，肿瘤体积抑制率分别为48%与50%，病理切片单核细胞密度高于对照组（P<0.01），但用药两组间肿瘤体积和瘤重及病理切片单核细胞密度差异无显著性（P>0.05）。当MCP-1浓度为0.1 ng/ml时，肿瘤重量抑制率为4%，肿瘤体积抑制率为2%，病理切片单核细胞密度无明显增高，与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。
表2 对照组及实验各组荷瘤裸鼠肿瘤体积与重量 （略）
表3 实验各组与对照组之间每连续10个高倍视野单核细胞分布之比较 （略）
3 讨论
早期研究表明TIL在肿瘤原位一般处于免抑制状态，使肿瘤得以生长。趋化因子是能使细胞发生趋化作用的细胞因子。单核细胞、自然杀伤细胞，嗜碱粒细胞和激活记忆的T细胞，是有MCP-1受体并且对MCP-1有反应能力的细胞 ［4］ 。国外实验证实:MCP-1可激活T细胞克隆增殖，并分泌IL-2，Ca 2+ 和IL-2的协同作用可增加可溶性CD25表达，促进T细胞生长，CD28配体可进一步增强上述效应 ［5］ 。对MCP-1产生应答的主要为CD45RA - 、CD45RO + 、CD4 + 、CD8 + 等活化记忆T细胞，它们参与抗原识别和信号转导，并且在细胞克隆中观察到上述效应 ［6］ 。Taub DD研究证实:MCP-1能诱导杀伤性T细胞（CTL）脱颗粒和释放酯酶，促进Th1和Th2细胞克隆化，释放多种淋巴因子，上调T细胞功能，增强机体免疫反应 ［7］ 。在本实验中观察到，当MCP-1作用浓度为1ng/ml时，TIL增殖密度显著提高（P<0.01）。但MCP-1浓度过低时，对TIL细胞增殖无明显促进作用。浓度过高，反而抑制细胞增殖。说明MCP-1在一定浓度时可以有效地刺激TIL增殖。MTT法测定不同浓度的MCP-1诱导TIL，当MCP-1为1ng/ml时其细胞毒性明显增强。在裸鼠动物实验中，我们观察到MCP-1对于人膀胱肿瘤生长具有抑制作用，当MCP-1浓度为0.5ng/ml及5ng/ml时，与生理盐水对照组相比，瘤体体积、瘤重及单核细胞密度，用药组与对照组彼此之间差异有显著性，但两组间抑瘤作用差异无显著性，当MCP-1浓度为0.1ng/ml时，则无明显抑瘤作用，说明MCP-1的治疗浓度应该采用最适剂量。众所周知，机体对肿瘤的免疫应答首先表现在局部，肿瘤局部组织内的免疫反应与全身免疫并不一致。通过腹腔注射MCP-1使肿瘤局部单核细胞密度明显升高，起到了抑制肿瘤生长的作用。MCP-1能诱导CD11c、CD11b表达，后者与CD23结合可促进氧化物产生和IL-1、IL-6、TNF-α分泌，并调理单核细胞吞噬功能 ［8］ 。有学者报道，虽然MCP-1表达较高的肿瘤和转基因细胞体外生长活性无明显差异，但动物体内成瘤力却明显下降和消失，肿瘤生长缓慢浸润细胞数量可增加2倍以上 ［9］ 。有人把转基因肿瘤细胞作为疫苗免疫动物，发现动物对再 次接种肿瘤细胞的抵抗力较对照组增强了100倍以上 ［10］ 。在我们的实验中可以发现MCP-1对TIL细胞的强弱取决于MCP-1的局部浓度、TIL细胞的敏感性以及同时存在的其他细胞因子的影响。通过本实验证明了MCP-1对TIL有促进增殖作用，并且可增强TIL对EJ细胞的杀伤。应用裸鼠实验可以更好地观察MCP-1对单核细胞抗肿瘤作用的影响。Marcella Reale ［11］ 等报道BCG膀胱灌注后，患者外周血单核细胞中MCP-1的表达均显著升高，在TUR-BT的标本中，与未经BCG灌注的治疗组相比，BCG灌注治疗的患者标本MCP-1出现高表达。为提高膀胱肿瘤的免疫治疗效果，减少副作用，提供了新的思路，但真正将MCP-1应用于临床，将其增强抗肿瘤的机制完全弄清楚，还需做更多的工作。
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作者单位:1610041四川大学华西医院泌尿外科 730030兰州医学院第二附属医院泌尿研究所