CyclinE在急性白血病中的表达及临床意义

　　CyclinE是属于G期细胞周期的正调节因子。是CDK 2 （周期素依赖激酶）的调节亚基。参与G 1 /S转换点功能调控。CyclinE在多种肿瘤中有基因扩增及过表达，被证实为是一种癌基因 ［1］  。目前，国外学者研究发现急性白血病（AL）的细胞周期存在异常调节。CyclinE在AL中也有异常表达，且可能与病情发展及预后有关 ［2］  。我们采用蛋白印迹法Western-blot检测22例AL患者CyclinE蛋白的表达并讨论其临床意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　22例AL患者，男12例，女10例，年龄18～66岁，平均35.8岁。按FAB诊断，经免疫分型证实，急性淋巴细胞白血病（ALL）12例，初治10例，复发2例。急性髓细胞性白血病（AML）10例，均为初治（M 1 型1例，M 2 型2例，M 3 型1例，M 4 型2例，M 5 型4例）;正常对照组10例，男女各5例，年龄20～46岁，平均36.5岁。AL患者组与正常对照组在年龄、性别上差异无显著性。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集

　　取初诊AL患者（包括2例AL复发者）新鲜骨髓液4ml。置于肝素液管中。加等量PBS液稀释后用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS液洗涤3次。调整单个核细胞数为2×10 9 /ml，70℃保存备测。对照组方法如上。

　　1.2.2 试剂

　　对照物购于晶美公司。以PBS代替一抗为阴性对照。

　　1.2.3 检测方法

　　制备10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（方法略）。将凝胶固定于电泳装置上，上下槽加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液:取单个核细胞20μl加入等体积2×SDS上样缓冲液;100℃，5min，同时将蛋白Marker及阳性对照，100℃加热3min;依次在上样中加入MarKer5μl，阳性对照20μl，标本（包括患者及正常对照）20μl，将电泳装置接电源，直至溴酚蓝到达分离胶底部，取出凝胶浸泡于转移缓冲液中，平衡15min，将滤纸和硝酸纤维素滤膜（NC膜）浸泡在转移缓冲液中约15min，接电转移装置，连接电源2h，取出NC膜放于丽春红染液约10min。蛋白带出现后，用防水笔描出蛋白MarKer的条带，加样顺序后将每条条带剪开（便于操作），然后去离子水漂洗NC膜，至蛋白带消失。将NC膜放入培养皿中，加入5%脱脂奶粉或3%小牛血清白蛋白封闭过滤，4℃，过夜。倒出封闭液后，在NC膜上滴加抗CycLinE抗体（阴性对照滴加PBS液），室温下孵育2h，然后用PBS漂洗NC膜3次，每次10min。在NC膜上滴加辣根过氧化酶标记的二抗，室温下孵育1h，然后用PBS漂洗NC膜3次，每次10min，之后将NC膜放入DAB染液中，平缓摇动直至特异性染色蛋白带清晰可见，把NC膜迅速放入去离子水中终止反应。
取出NC膜，用滤纸吸干水。待背景脱色后，用佳能数码照相机照相记录结果。

　　1.2.4 判断

　　NC膜上出现2条棕黄色条带的样本为CyˉclinE阳性表达。

　　1.3 统计学分析

　　所有数据均由SPSS10.0统计软件处理。应用四格表X 2 检验，四格表确切概率法。

　　2 结果

　　2.1 AL患者和正常对照CyclinE表达结果 见表1。结果显示AL患者CyclinE阳性表达率明显高于正常对照组，两组差异有显著性（P<0.05）。AML患者CyclinE阳性表达率高于ALL患者。

　　表1 急性白血病患者CyclinE表达略
 
　　2.2 患者中CyclinE蛋白表达与缓解率的关系 见表2。结果显示CyclinE阳性表达的AL患者缓解率低于CyclinE

　　阴性表达的AL患者，两者差异有显著性（P<0.05）。

　　表2 AL患者CyclinE蛋白表达与缓解率的关系略
   
　　3 讨论

　　急性白血病是严重危害人民健康的恶性肿瘤，其发病机制极其复杂，主要为造血干细胞染色体多重损伤最终引起细胞周期调控紊乱，导致造血细胞增殖、分化异常。CyˉclinE作为一种细胞周期调控因子参与急性白血病细胞周期的调控，在肿瘤细胞的形成和发展中起了重要作用。Liˉda等 ［2］  和Scuderi等 ［3］  均采用Western-blot法分析急性白血病细胞Cycline的表达，发现急性髓细胞性白血病（AML）和急性淋巴细胞性白血病（ALL）复发者均有CyclinE的阳性表达。国内尚未见到用Western-blot法检测急性白血病患者CyclinE表达的报道。

　　本研究采用Western-blot法分析了包括20例初治和2例复发AL患者及10例正常对照CyclinE的表达，结果显示ALL和AML患者均有CyclinE的高表达，明显高于正常对照组，其中AML患者阳性表达率更高，但与ALL患者无明显差异，提示CyclinE在成人的AL患者中有异常高表达。AML患者CyclinE阳性表达率为50%明显高于Lida等研究结果（表达率27%），可能与这组AML病例中M 4 、M 5 （6/10）所占比例大有关。临床上AML中M 4 、M 5 型治疗效果及预后差是否与CyclinE高表达有关，有待进一步研究。在ALL患者中，2例复发患者均有CyclinE高表达，与Scuderi等研究结果一致，同时还发现2例复发患者未复发时，CyclinE也为强阳性表达，这一现象是否提示CyclinE表达与复发有关，有待后扩大样本进一步研究。我们还观察了AL患者缓解前后CyclinE的表达，发现经治疗缓解后的患者CyclinE表达水平下降，两者差异有显著性;进行随访观察时发现，CyclinE阳性表达的AL患者缓解率低于CyclinE阴性表达的AL患者，此结果与Lida、王颖 ［4］  等研究结果相符，提示CyclinE表达对AL患者在监测病情进展、判断预后方面有重要的临床意义。

　　参考文献

　　1 Haas K.Malignant transformation by CyclinE and Ha-Ras correlates with lower sensitivity towards induction of cell death but requires funcˉtional Myc and CDK4.Oncogene，1997，20，15（21）:2615.

　　2 Iida H，Towatari M，Tanimoto M，et al.Overexpression of cyclin E in aˉcute myelogenous leukemia.Blood，1997，90:3707-3713.

　　3 Scuderi R，Palucka KA，Pokrovskaja K，et al.Cyclin E overexpression in relapsed adult acute lymphoblastic leukemias of B-cell lineage.Blood，1996，87:3360-3367.

　　4 王颖，徐世荣.细胞周期E与白血病.中华血液学杂志，2001，22（4）:219-221.     

　　作者单位:　650101云南省昆明医学院第二附属医院血液科　云南省昆明医学院第一附属医院检验科　云南省红十字会医院