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The effect of paclitaxel on expression of autocrine motility factor in hepatobiliary cancer cell lines Liu Bin，Cui Hongzun，Zhang Xiuzhong，et al.Department of General Surgery，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu221002.
【Abstract】 Objective To study the effect of paclitaxel（PTX）on the expression of autocrine motility factor（AMF）in SMMC-7721/HCCC-9910cancer cells and discuss the possible mechanism of the motility inhibition of cancer cell.Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to measure the exˉpression and the amount of the AMF mRNA in these cells.Results Both of SMMC-7721and HCCC-9910cells expressed AMF，which could be down-regulated with increasing concentration of PTX treatment detected by RT-PCR semi-quantitative determination.Conclusion The AMF is expressed in the SMMC-7721and HCCC-9910cells and can be inhibited by PTX treatment.
Key words paclitaxel hepatobiliary cancer autocrine motility factor
细胞运动是肿瘤细胞转移的先决条件。既往的研究发现紫杉醇（PTX）可抑制细胞的运动，其确切机制尚不清 ［1］ 。多种因子包括自分泌和旁分泌对肿瘤细胞的运动都有影响，其中自分泌运动因子（autocrine motility factor，AMF）与肿瘤的关系，近年来受到学术界的重视 ［2］ 。抑制AMF的合成，可望抑制肿瘤的迁移。本研究观察了AMF在SMMC-7721肝癌细胞及HCCC-9910胆管癌细胞中的表达，以及PTX对其表达的影响，探讨PTX抑制肿瘤细胞运动可能的机制。
1 实验材料和方法
1.1 细胞株及主要试剂 人肝癌细胞株SMMC-7721及人胆管癌细胞株HCCC-9910购自上海细胞生物研究所。AMF引物（上游序列:5’-TAA AAC AGT ACG TGG AAG GCA GTT-3’，下游序列:5’-GTT GAT AAG ACT GTA CTG GAC ATG-3’）及β-action（上游序列:5’-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3’下游序列:5’-AGG GGC CGG ACT CGT CAT CAT-3’）购自上海实生细胞生物技术公司。Acˉcess RT-PCR System试剂盒购自Promega公司。
1.2 细胞培养 将SMMC-7721、HCCC-9910细胞株培养于RPMI-1640培养液中（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，pH7.0～7.2），于37℃、5%CO 2 培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3 总RNA提取及RT-PCR 用promega公司Total RNA Isolation提取总RNA ［3］ ，用Promega公司的Access RT-PCR System进行反转录。将反应管放入PCR仪，按下列次序进行循环94℃1min1cycle，94℃30s、57℃1min、68℃2min35cycle，68℃7min1cycle。反应完毕后取出反应管，置于-20℃冰箱内待电泳。琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR产物半定量分析电泳分析PCR产物，并用标准PCR标志对照。照相记录特异条带，激光密度扫描仪分析含PCR产物带的摄影底片，测定其吸光值。AMF基因表达
值=（AMF的吸光值/β-actin的吸光值）×100%。
2 结果
2.1 AMF在肝癌、胆管癌细胞的表达 经PTX（15，30μg/ml）处理的SMMC-7721肝癌细胞、HCCC-9910胆管癌细胞和未处理的SMMC-7721肝癌细胞均表达AMF基因。见图1。
2.2 PTX对AMF表达的影响 不同浓度PTX处理24h后SMMC-7721肝癌细胞、HCCC-9910胆管癌细胞进行AMF/β-actinPCR结果半定量分析，AMF表达水平随着PTX浓度增加而下降（表1、2），经拟合曲线，求出方程，分别为:Y=1.1606+0.0108X-0.5X 2 Y=1.1239+0.01202X-0.5X 2R 2 分别为0.9381、0.9789。对2种细胞的AMF/β-actin PCR值进行比较，差异无显著性（P>0.05）。图1 PTX（15μg/ml，30μg/ml）处理24h的SMMC-7721肝癌细胞、HCCC-9910胆管癌细胞和未处理的SMMC-7721肝癌细胞AMF基因的表达。M:maker，1:对照组，2:15μg/ml SMMC-7721，3:30μg/ml SMMC-7721，4:15μg/ml HCCC-9910，5:30μg/ml HCCC-9910
表1 不同浓度PTX处理24h后SMMC-7721肝癌细胞的AMFβ-actin cDNA （略）
表2 不同浓度PTX处理24h后HCCC-9910胆管癌细胞的AMF/β-actin cDNA
3 讨论
肝胆肿瘤恶性程度高，临床发现时多为中晚期且常有局部浸润和远处转移，手术切除率低，术后长期存活率低，主要为肿瘤的局部复发和远处转移。与肿瘤转移有关的因素很多，其中肿瘤细胞活跃的移动能力是浸润生长的重要因素。许多实验表明:具高度侵袭力的肿瘤细胞，往往同时具有活跃的移动能力。Stoker等 ［4］ 认为，癌转移的发生由运动因子（motogen）所启动。运动因子能刺激癌细胞多方面的运动，包括细胞迁移、化学趋化运动、吞噬运动、接触趋化运动等。Niinaka等 ［5］ 研究显示，正常细胞和肿瘤细胞均能表达自分泌运动因子基因产物，但在肿瘤细胞中呈过度表达。
原发部位的肿瘤细胞分泌的AMF与其瘤细胞的相应受体 结合，一方面可以激发细胞骨架成分收缩，引起癌细胞运动。另一方面能诱导基质降解酶激活，形成局部溶解区，以构成癌细胞运动通道，促进浸润转移 ［6］ 。我们的实验证实AMF在SMMC-7721肝癌细胞及HCCC-9910胆管癌细胞均有表达，说明了肝癌、胆管癌具有高度侵袭能力可能的分子机制。
PTX作为较有前景的抗肿瘤药物已被广泛用于治疗各种肿瘤。该类药物可导致微管组成的改变或使其重新排列。微管的功能除在细胞分裂时形成有丝分裂纺锤体之外，还与细胞形态的维持、细胞的粘附、运动及信号转输等有关 ［7］ 。在某些细胞类型，微管具有运输细胞内小泡及微粒的功能 ［8］ ，因而PXT可干扰蛋白酶小泡的转输以及胶原酶的分泌。Mark等报告相当低浓度的泰素可抑制3种类型胶原酶的分泌从而在体外实验中完全抑制细胞向基质、IV型胶原以及塑料基质的粘附 ［9］ 。由此可见TXT可通过干扰微管的这些基本功能而抑制细胞的运动和迁移。我们既往的研究发现PTX类药物能通过抑制肿瘤细胞的运动功能而降低肿瘤细胞的侵袭能力 ［10］ 。本实验研究发现PTX可抑制SMMC-7721、HCCC-9910细胞AMF的表达值，且在低浓度时也有抑制作用，并随PTX浓度的增加而增加，提示PTX类药物可能通过影响AMF的表达而抑制细胞运动。
参考文献
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作者单位:221002江苏省徐州医学院附属医院普外科