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Relationship of Stat3with its target gene products and VEGF in nasopharyngeal carcinoma
Yao Yunhong，Li Feihong，Cai Qiongzhen，et al.
Department of Pathology，Guangdong Medical College，Zhanjiang524023.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between stat3with its target gene products including Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in Nasopharyngeal carcinoma（NPC），and to explore the mechanism tumorigenesis of NPC.Methods The expressions of stat3、Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF proteins in paraffin-embedded specimens of29cases of chronic nasopharyngitis，60cases of NPC and28cases of lymph-node metastasis were studied by imˉmunohistochemical method（SABC）.Results The positive rate of stat3、Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in chronic naˉsopharyngitis were41.38%（12/29），34.48%（10/29），27.59%（8/29），24.13%（7/29）respectively;the expresˉsion of Stat3Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in nasopharyngeal carcinoma were73.33%（44/60）、68.33%（41/60）、55.00%（33/60）、80.00%（48/60）with significant difference compared with chronic nasopharyngitis respectively;The positive rate of stat3、Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in lymph-node metastasiswere85.71%（24/28），75.00%（21/28），71.43%（20/28），82.14%（23/28）with significant difference compared with chronic nasopharyngitis reˉspectively，There were no significant difference between NPC and lymph-node metastasis.Spearman correlation analyˉsis showed there were significant correlation between the expression of stat3、Cyclin D1and VEGF in NPC and lymph nodes metastasis.Conclusion stat3and VEGF may play an important role in the development of NPC，VEGF gene may be regulated directly by stat3protein. Key words nasopharyngeal carcinoma Stat3 VEGF immunohistochemical
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种具有显著种族及地理分布特点的恶性肿瘤，以我国华南及东南亚地区高发，95%以上属于低分化和未分化癌类型，恶性度高、生长快、容易出现淋巴或血行转移。侵袭和转移是其最本质的生物学特征，也是导致病人死亡的主要原因。肿瘤的发生发展都离不开新生血管生成，以获得肿瘤细胞生长和转移所需的营养物质。因此，抑制肿瘤血管生成已成为当前肿瘤治疗的重要策略。血管内皮生长因子（VEGF）是最重要的血管生成因素之一，最近有报道VEGF基因直接由信号传导与转录激活因子（signal transduction and activators oftranscription，STATs）蛋白调节［1］。本实验对慢性鼻咽炎、鼻咽癌和鼻咽癌颈部淋巴结转移灶标本进行了Stat3及其靶基因产物（cyclin D1、Bcl-xL）和VEGF表达的检测，并探讨二者之间表达的关系，为鼻咽癌的抗血管生成治疗提供依据。
1 材料和方法
1.1 一般资料 经病理诊断证实的慢性鼻咽炎29例，人鼻咽癌活检组织60例，鼻咽癌颈部淋巴结转移28例。按WHO分型均为鼻咽分化型非角化性癌（由广东医学院第二附属医院耳鼻喉科和高州市人民医院耳鼻喉科提供）。所有病例资料完整，鼻咽癌及鼻咽癌颈部淋巴结转移病人诊断前未经任何抗癌治疗。标本均用10%福尔马林固定。常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
1.2 免疫组化方法 按常规ABC方法进行免疫细胞化学染色。检测Stat3、Cyclin D1、Bcl-xL和VEGF蛋白的表达。使用抗体均购于Doka公司，所用抗体的工作浓度:鼠单抗Stat3为1:50PBS稀释，Cyclin D1为1:50PBS稀释、Bcl-xL和VEGF为1:100PBS稀释，ABC Kit为Vector产品。
1.3 结果判断 每一批免疫组化均设有已知的阳性和用PBS代替的阴性对照。观察切片至少5个具有代表性高倍视野，不少于1000个细胞，对免疫组化结果进行评估。Bcl-xL和VEGF蛋白表达定位于细胞质，癌细胞染成棕黄色者为阳性细胞。判断方法为镜下观察:阳性细胞<10%为阴性表达;10%～50%为阳性表达;>50%为强阳性表达。Stat3、Cyclin D1主要定位于细胞核，部分定位于细胞质，结果判断参考文献进行 ［2］ :（1）按阳性细胞百分率计分:阳性细胞<10%计0分;10%～50%计1分;>50%计2分。（2）按染色强弱计分:淡黄色计0分;黄色计1分;棕黄色计2分。两项合并得0～1为阴性;2～3分为阳性;4分为强阳性。
1.4 统计学处理 采用SPSS10.0做卡方检验和Spearman相关分析。
2 结果
2.1 Stat3、Cyclin D1、Bcl-xL和VEGF蛋白在鼻咽良恶性病变中的表达 29例鼻咽粘膜慢性炎中Stat3阳性表达为41.38%（12/29），Bcl-xL阳性表达为34.48%（10/29），Cyˉclin 1阳性表达为27.59%（8/29），VEGF阳性表达为24.13%（7/29）;60例鼻咽癌中Stat3、Bcl-xL、Cyclin D1和VEGF表达阳性率分别为73.33%（44/60）、68.33%（41/60）、55.00%（33/60）、80.00%（48/60）;与鼻咽粘膜慢性炎组比较Stat3、CyclinD1、Bcl-xL和VEGF差异均有显著性（P<0.05）。28例鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中Stat3表达阳性率为85.71%（24/28），Bcl-xL表达阳性率为75.00%（21/28），Cyclin D1表达阳性率为71.43%（20/28），VEGF表达阳性率为82.14%（23/28）;与鼻咽癌组比较差异均无显著性（P>0.05）。见表1。表1 多基因蛋白在鼻咽良恶性病变中的表达 例（略）注:①鼻咽癌与鼻咽粘膜慢性炎比较P<0.05;②鼻咽癌颈部淋巴结转移灶与鼻咽癌比较P>0.05。
2.2 鼻咽癌中Stat3、Bcl-xL、Cyclin D1和VEGF表达的相关分析 经Spearman相关性分析结果;在鼻咽癌组织中Bcl-xL和VEGF的表达无显著相关性（分别r=0.124，P>0.05），Stat3、Cyclin D1与VEGF的表达有显著相关性（分别r=0.397，P<0.05;r=0.457，P<0.05）。
2.3 鼻咽癌颈淋巴结转移灶中Stat3、Bcl-xL、Cyclin D1和VEGF表达的相关分析 经Spearman相关性分析结果:在鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中Bcl-xL和VEGF的表达均无显著相关性（分别r=0.158，P>0.05），Stat3、Cyclin D1与VEGF的表达有显著相关性（r=0.413，P<0.05;r=0.437，P<0.05）。
3 讨论
Stats由Fu等 ［2］ 首次鉴定，癌细胞的增殖由STAT基因启动，经过JAK/STAT信号转导（JAK/STAT signaling）及CDK的调节，然后分裂繁殖。目前的研究显示，Stat3在多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌以及前列腺癌等多种肿瘤组织与细胞系中异常表达或活性增强 ［3］ ，提示Stat3调控异常与肿瘤发生、发展密切相关。马向涛 ［4］ 对结直肠癌研究发现Stat3信号转导通路可能在结直肠癌的发生、发展过程中起重要作用，检测结直肠癌中Stat3及其靶基因产物的表达可以反映肿瘤的恶性程度。本实验显示在鼻咽癌组织内Stat3及其靶基因产物的表达明显高于慢性鼻咽炎组，提示Stat3过度表达可能在鼻咽癌的发生、发展过程中发挥重要作用，其表达与鼻咽癌淋巴结转移密切相关。肿瘤侵袭、转移与血管生成密切相关，血管内皮生长因子（VEGF）是最重要的血管生成因素之一，血管内皮生长因子通过与其受体的相互作用调控血管生成，血管新生对于原发癌和转移癌的生长都十分重要，在肿瘤组织中VEGF表达亢进，与肿瘤组织的微血管密度、预后及转移密切相关，此外VEGF与一些癌基因表达密切相关 ［5］。VEGF阻止 剂通过抑制血管增生，抑制肿瘤和微小转移灶的形成，达到治疗肿瘤的目的。本研究结果显示，在鼻咽癌及鼻咽癌颈淋巴转移组织中VEGF明显高于慢性鼻咽炎组织，表明VEGF可能在鼻咽癌的生长及转移中发挥重要作用。最近有研究报道 ［6］在胰腺癌Stat3可能直接调节VEGF，从而调节肿瘤的血管形成。Niu等 ［6］用显性阴性的Stat3蛋白（即Stat3b，一种Stat3的突变形式），可抑制Stat3的活性及Stat3反义寡核苷酸阻断Stat3的信号转导，均可下调VEGF的表达，同时他们通过染色质免疫沉淀检测，发现Stat3蛋白在体内结合于VEGF的启动子，且VEGF启动子上Stat3结合位点的突变会使v-src介导的VEGF启动子的活性丧失，因此，他们认为VEGF基因是直接通过Stat3蛋白来调节的，并且认为Stat3在阻断由多种信号途径介导的肿瘤血管生成策略中是一个共同的分子靶。也就是说阻断Stat3即可阻断血管生成，阻止肿瘤的生长和转移。在鼻咽癌及鼻咽癌颈淋巴结转移组织中Stat3及其靶基因产物（cyclin D1）表达与VEGF密切相关，能否通过阻断Stat3阻止鼻咽癌的生长和转移，有待进一步研究。
有研究报道抑制Stat3表达及活性可使凋亡抑制蛋白Bcl-XL表达明显下调，Stat3可能通过调控Bcl-xL而影响头颈部鳞癌细胞凋亡。Masuda ［7］等发现，Stat3持续活化与HNSCC分期及淋巴结转移相关 ［8］，Stat3是癌基因，但是它本身并不直接引起癌变，而是通过激活其靶基因而诱导某些关键基因产物的表达来影响肿瘤发生，其中包括调节细胞周期的cyclin D1和影响凋亡的BcL-xL。Huang等 ［9］发现Stat3在卵巢癌细胞系MDAH2774与CAOV-3中持续激活，阻断Stat3活化可以抑制Cyclin D1蛋白表达。Cyclin D1可通过调节细胞周期使之始终处于旺盛分裂状态而促使细胞恶性变。已发现多种肿瘤中都有Cyclin D1的高表达，是以细胞增殖能力旺盛，能够不断分裂增殖而最终形成肿瘤。本研究发现:鼻咽癌组织和鼻咽癌颈部淋巴结转移灶Stat3表达与活性升高，cyclin D1表达变化趋势与Sta3同步，鼻咽癌组织中Stat3与Cyclin D1表达情况呈线性正相关，其可能机制是Stat3与CyclinD1启动子上的Stat3位点结合而启动转录，促进癌细胞增殖而导致鼻咽癌发生。凋亡抑制因子BcL-xL是Stat3的另一重要靶基因产物。应用Stat3显性负性质粒阻断骨髓瘤U266细胞中的Stat3通路后，可以观察到BcL-xl蛋白表达下调，U266细胞凋亡数量增多 ［10］。Burke等 ［11］应用酪氨酸激酶抑制剂AG490作用于卵巢癌细胞系DAH2774与CAOV-3，发现Stat3蛋白表达与活性降低，凋亡抑制蛋白BcL-xL表达同步下调，卵巢癌细胞出现凋亡。本研究发现:鼻咽癌中Stat3及BcL-xL表达升高，但是统计学分析并没有相关性，鼻咽癌中Stat3对Bcl-xL的调控机制还需进一步研究。总之，Stat3信号转导通路异常活化可能在鼻咽癌的发生、发展过程中起重要作用。
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基金项目:广东省卫生厅A2001466
作者单位:524023广东湛江广东医学院病理学教研室