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【摘要】 目的 探讨大鼠急性肺损伤（ALI）过程中，信号转导和转录活化因子-3（STAT3）的活化规律，及其与细胞因子白介素-6（IL-6）的相关性。方法 健康雌性Wistar大鼠（190±10）g 50只，随机分为生理盐水(NS)组(10只)，尾静脉注射NS，2h后处死；LPS模型组（40只），尾静脉注射内毒素（LPS）（5mg/kg），分别于注射LPS后1、2、4、6h时取材。原位杂交法测定肺组织中STAT3的基因表达，放免法检测血和肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的浓度，将二者进行相关性分析。结果 急性肺损伤后，在多种肺细胞中均可观察到STAT3的基因表达增加，包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞以及炎性细胞；正常肺组织STAT3基因弱表达，LPS损伤后肺组织中STAT3的基因表达逐渐增高，4h达峰值，随后其水平逐渐下降，血及BALF中IL-6的浓度变化与STAT3的基因表达相一致，且二者之间明显相关。结论 在急性肺损伤的早期伴随有信号转导JAKs- STAT3通路的激活，IL-6是STAT3通路活化的机制之一。
【关键词】 信号转导；转录活化因子-3；急性肺损伤；白细胞介素-6
The expression of STAT3 in acute lung injury rats
GONG Qing-mei,REN Wen - xia,ZHAO Ying,et al.
Department of Respiratory Medicine,The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
【Abstract】 Objective To investigate the activation law of signal transducers and activators of transduction-3(STAT3) and whether cytokine IL-6 can activate STAT3 in acute lung injury (ALI) of rats. Methods 50 female Wistar rats (190±10g) were randomly divided into NS group（n=10）, ALI groups(n=40). After intravenous injection of endotoxin (5mg/kg) from tail vein, animals were killed at 1th, 2th, 4th and 6th hour. Detection of STAT3 gene expression of lung tissue with in situ hybridization(ISH) and measurement of the concentration of IL-6 in blood and BALF with radioimmunoassasy.Results LPS treatment resulted in STAT3 activation throughout the resident lung cells, as well as in the recruited inflammatory cells. STAT3mRNA expression in lung constitution increased gradually, peaked at 4th hour and started to decrease at 6th hour. The change of IL-6 concentration in blood and BALF is consistent with the changes of STAT3mRNA expression, and the two is positively correlated. Conclusion The experimental result shows the JAK-STAT3 pathway is activated at early phase of ALI; IL-6 may activate STAT3 pathway at early phase of ALI.
【Key words】 signal transducers；activators of transduction-3; acute lung injury; IL-6
信号转导和转录活化因子（signal transducers and activators of transduction，STAT）家族作为潜在的细胞转录因子介导了多种生物学效应，其中STAT3是 STAT家族的重要成员，它可以被多种细胞因子和生长因子活化。近年来对信号转导的研究发现，STAT蛋白家族在急性肺损伤时有表达，其中STAT3蛋白是以一种抗炎性蛋白存在，对急性肺损伤起到一定的自身保护作用［1］。本实验以内毒素（LPS）造成急性肺损伤模型，来观察肺组织中STAT3的基因表达规律及其可能的激活因子。
1 材料与方法
1.1 材料 雌性健康Wistar大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供；内毒素（lipopolysaccharide, L-2880 055: B5）、DEPC水为美国Sigma公司产品；STAT3原位杂交试剂盒、DAB显色液及原位杂交盖玻片均购自武汉博士德公司；碘（125I）IL-6放免试剂盒购自北京北免东雅生物技术研究所。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及模型 50只雌性健康Wistar大鼠（190±10）g，随机分为5组。用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉：（1）生理盐水对照组（10只）： 尾静脉注射生理盐水（2ml/kg体重），约2h后处死，采集标本；（2）LPS模型组（40只）：尾静脉注射LPS（5mg/kg体重），分别于注射LPS 1、2、4、6h后活杀大鼠采集样品，各时相点各10只。各组动物剖腹，腹主动脉取血后处死。留取血清冻存于-20℃冰箱保存备用。经气管插入12号针头管于左侧肺组织，以4℃生理盐水分别按1.5、1、1ml灌洗3次，缓慢回抽灌洗液，以1500r/min离心10min，取上清冻存于-70℃冰箱保存待测IL-6值。取右下肺组织约0.5cm×0.5cm大小组织块，固定于10%中性甲醛，石蜡包埋后行（HE）染色及病理学观察。取右中肺组织约0.3cm×0.2cm大小组织3~4块，固定于4%多聚甲醛（内含0.1%DEPC水），6h后石蜡包埋。
1.2.2 原位杂交检测STAT3mRNA的表达 4%多聚甲醛固定的肺组织经石蜡包埋切片，置于经10%多聚赖氨酸（内含0.1% DEPC水）处理的载玻片上，切片厚度6μm，60℃烘烤过夜。常规脱蜡至水；3%过氧化氢溶液孵育10min，消除内源性过氧化氢酶活性；3%枸橼酸新鲜配置的胃蛋白酶室温处理20min；滴加预杂交液，40℃孵育4h；滴加杂交液，以原位杂交专用盖玻片覆盖，湿盒40℃温箱孵育过夜；滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60min；滴加SABC，37℃ 20min；滴加生物素化过氧化物酶，37℃ 20min；DAB溶液显色23min，蒸馏水充分洗涤；苏木素轻度复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以PBS缓冲液代替杂交液，其他步骤不变。
1.3 结果判定 阳性染色为细胞浆内棕黄色着色颗粒，细胞核内少量着色。采用Mias-2000细胞图像分析仪对染色结果行半定量分析，在显微镜(×200)下以相同外部条件(亮度)摄取bmp图像，每张切片摄10副，STAT3mRNA原位杂交图像行平均光密度值测定，每张切片取均值。
1.4 血及支气管肺泡灌洗液中IL-6的测定 将冻存的血清及支气管肺泡灌洗液置于室温下复融、混匀，采用放免法检测，操作严格按照试剂盒说明书。该试剂盒灵敏度：＜50pg/ml。
1.5 统计学分析 实验数据采用SPSS 13.0软件包进行分析，数据以（x±s）表示，采用q检验、方差分析和直线相关分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 肺组织病理学改变 注射LPS后1h大鼠肺组织尤其是肺血管内中性粒细胞（PMN）滞留、聚集，以后随时间延长，各组PMN滞留、聚集现象更加严重，并有向毛细血管外移行趋势，肺泡腔逐渐缩窄，肺泡隔明显增厚。生理盐水对照组大鼠肺组织结构正常。表明模型制备成功。
2.2 ALI不同时间段肺组织中STAT3mRNA的表达 镜下结果显示：STAT3mRNA在正常肺组织弱表达，LPS损伤后，表达逐渐增多，同时可看到在多种肺组织细胞中均可观察到STAT3mRNA的表达，包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞肺血管内皮细胞及炎症细胞等，见图1~5。
经图像分析得出不同时间段肺组织中STAT3mRNA的表达情况：正常肺组织有少量STAT3mRNA的表达，其平均光密度值为0.13±0.5，LPS损伤1h后STAT3mRNA表达开始升高，2h明显表达，4h达峰值，6h表达有所下降，经统计学分析，各组间比较，P<0.05，差异有显著性，见表1。
表1 对照组及LPS损伤后不同时间段STAT3mRNA表达的平均光密度值比较（略）
注：经方差分析显示，LPS1h组与对照组比较，P<0.05；LPS6h与LPS4h、LPS2h比较，P<0.01；余各组间P<0.001
2.3 血清及支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的值 IL-6在正常血清和BALF中均可测到，其浓度值分别为（74.71±14.96）pg/ml和（58.14±10.39）pg/ml，经LPS处理后1h血和BALF中IL-6值均上升，4h达峰值，6h后开始下降，经统计学分析显示各组间差异有显著性（P<0.05），见表2。
2.4 相关分析 血及支气管肺泡灌洗液中IL-6的浓度与急性肺损伤组织STAT3mRNA的表达的相关性分析显示，它们之间明显相关，相关系数r分别为0.936、0.889，P<0.01。
表2 血及BALF中IL-6浓度的变化(略)
3 讨论
JAK-STAT途径是细胞内最为简捷的信号转导通路之一，仅由JAK和STAT两部分组成。STAT主要有7个成员，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6［2,3］。其中STAT3是STAT家族的重要成员，广泛表达于多种类型的细胞和组织中，它可以被许多细胞因子和生长因子活化，包括IL-6、IL-11、IL-10、IL-12、白血病抑制因子、EGF、TGF-α、肝细胞生长因子、Leptin和G-CSF等［4］，从而调控着细胞的增生、存活、凋亡、炎症等生理功能和病理过程［5，6］。
本实验发现，LPS损伤肺组织的多种细胞中均有STAT3mRNA表达，包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞及炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）。图像分析提示，正常大鼠肺组织STAT3mRNA弱表达，经LPS损伤后1h STAT3的基因表达开始升高，2h表达明显，4h达峰值，随后STAT3mRNA的表达下调。我们的实验结果与沃德和其同事［3］所得结果一致,他们运用肺内IgG免疫复合物沉积，触发了炎症反应。结果发现，正常大鼠只有少量STAT3，而诱发急性肺损伤的大鼠肺内STAT3活性显著增高，到4h达到最高水平。
Severgnini M［7］等曾将培养的血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞以LPS直接刺激，并没有发现这两种细胞的STAT3的活化及基因表达的增加，而IL-6可使这两种细胞的STAT3活化。这说明在急性肺损伤过程中，并非LPS直接刺激肺组织细胞STAT3的活化和基因表达，而与细胞因子有关。实验证实，急性肺损伤过程中，IL-6主要是由单核/巨噬细胞分泌的，它可通过抑制中性粒细胞的迁移，抑制IL-1和TNF-α等的产生而发挥其抗炎特性［8］。在实验中我们观察了不同时间段血清及BALF中IL-6的水平，并与肺组织中STAT3mRNA的表达的相关性进行了分析，发现二者之间明显相关。这说明在LPS介导的肺损伤过程中，细胞因子IL-6可激活JAK-STAT3信号转导通路。沃德［4］等发现肺内STAT3的表达和激活与抗炎细胞因子IL-6、IL-10和补体激活物C5a的表达增加一致，并取决于中性粒细胞和肺巨噬细胞。中性粒细胞和肺巨噬细胞的缺失显著妨碍了STAT3激活，且IL-6和IL-10的表达减少。
急性肺损伤和ARDS是以弥漫性肺泡和毛细血管膜破坏导致的肺水肿和微肺不张为特征，肺泡和毛细血管膜的完整性以及肺泡表面的平衡对肺损伤起着重要的保护作用。体外实验发现，IL-6可刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞STAT3通路活化，促进表面活性蛋白（SP-B）的合成和分泌［9］。IL-6也可保护H2O2诱导的肺血管内皮细胞的损伤，而这种保护作用是通过或者说部分是通过STAT3通路来实现的［10］。Isamu Hokuto［11］等将大鼠STAT3的基因敲除，并以高氧造成急性肺损伤模型发现，STAT3的缺失引起了肺上皮及肺血管内皮的损伤，导致了动物过早的发生呼吸衰竭，而这种改变与SP-B的分泌减少密切相关，说明在急性肺损伤的过程中STAT3可通过SP-B的分泌来维持肺泡的完整性、肺泡表面平衡及肺的动力学的作用，从而对急性肺损伤起到保护作用。本实验结果提示在急性肺损伤过程中有IL-6可介导STAT3通路的活化，因此可以说在急性肺损伤的过程中IL-6可通过活化STAT3通路来发挥其对肺组织的保护作用。
综上所述，在急性肺损伤的早期伴随有JAKs-STAT3通路的活化，细胞因子IL-6可激活STAT3通路来发挥作用，而STAT3通路的激活可以对肺组织起到一定的自身保护作用。这为临床治疗急性肺损伤提供了一条新的思路和理论基础，假如我们能在肺损伤的早期使STAT3的活化明显升高，则可对有急性肺损伤的肺组织起到保护作用，从而防止疾病进一步发生发展。
（本文图片见封三）（略）
【参考文献】
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11 Isamu Hokuto, Machiko Ikegami. Stat-3 is required for pulmonary homeostasis during hyperoxia. J Clin Invest,2004,113:28-37.
（编辑：宋 青）
作者单位： 030001 山西太原，山西医科大学第二临床医院呼吸科（△通讯作者）