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关键词 病毒性心肌炎 柯萨奇病毒B 3 白细胞介素6
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115（2004）07-0592-03
Study of recombinant human interleukin-6（rhIL-6） treatment in acute
murine CVB 3m myocarditis
Liu Aihong，Li Jing，Cui Xiaodai，et al.
Capital Institute of Pediatrics，Beijing100020.
【Abstract】 Objective To determine if it is possible that IL-6can be used as an immune modulator on the clinic in the future.Methods We evaluated effects of recombinant human IL-6（rhIL-6）treatment at different time points in the acute murine CVB 3m myocarditis.Results （1）In the mice model，the concentration of IL-6inˉcreases on Day2，gets to the peak on Day3，and decreases to the normal level on Day7.（2）The significantly deˉcreased mortality on Day14and lower viral titer on Day5in the heart were observed in group A compared with group C（P<0.01，P<0.05）.As shown in histopathological studies，the pathological score of murine hearts in group A is much lower than that of group C（P<0.05），and so does the thymic atrophy.Conclusion IL-6level in mouse serum increases significantly in acute CVB 3m myocarditis.rhIL-6reduces myocardial damage in mice with viral myˉocarditis，but it acts differently if administrated on different time points after CVB 3m infection.Earlier administration of IL-6is beneficial to mice infected with the CVB 3m virus and with subsequent active viral myocarditis.
Key words viral myocarditis coxsackie virusB 3 interleukin-6
病毒性心肌炎是小儿常见的心血管疾病之一，威胁着小儿健康与生命，近年来有增加的趋势。国内外研究多年，其确切的发病机理尚不清楚 ［1］ 。近年来，大量研究显示各种细胞因子在病毒性心肌炎的发生发展中起重要作用。其中，IL-1、IL-2、TNF-α、IFN-γ等的研究及报道较多 ［2］ 。作为细胞因子网络中的重要成员，IL-6在病毒性心肌炎中作用的报道尚不多见。本研究对CVB 3m 诱发的小鼠急性心肌炎模型进行血清IL-6水平的动态观察，应用rhIL-6对小鼠在感染病毒的不同时间进行干预，以观察其效果;本研究旨在探讨细胞因子IL-6在病毒性心肌炎急性期的作用，为IL-6能否用于治疗或预防病毒性心肌炎提供实验室依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂 Balb/c小鼠，雄性，6～8周，由中国医学科学院动物所提供。柯萨奇病毒B组3型亲鼠心肌株（CVB 3m ，Nancy株），来自Huber实验室，并在Hela细胞上测得感染滴度为1.34×10 3 PFU/ml，保存于-70℃。Hela细胞由首都儿科研究所生化室提供。rhIL-6购自军事医学科学院邦定公司，系大肠杆菌表达产物，活性为1×10 8 单位/mg。小鼠IL-6酶联免疫检测试剂盒购自Endogen Co.U.S.A.。
1.2 模型的建立及血清IL-6水平的检测 Balb/c小鼠160只随机分为两组:感染组140只，经腹腔注射CVB 3m 0.5ml/只，感染动物室分笼饲养;正常对照组20只，经腹腔注射无血清Eagle’s液0.5ml，洁净动物房分笼饲养。感染组于感染后第1、2、3、5、7、10、14天随机取10～12只留取血液和心脏标本;正常对照组于感染后第3和第7天各取10只留取标本。常规分离血清，冻存于-30℃至同批以ELISA法检测IL-6浓度。
1.3 rhIL-6干预实验 Balb/c小鼠180只，随机分为A、B、C、D、E、F组，A、B、C、D为CVB 3m 感染组，每组40只小鼠，经腹腔注射CVB 3 m0.5ml/只;E组为正常对照组，F组为正常给药组，每组10只小鼠。rhIL-6用药剂量为每只小鼠每次0.1ml（5×10 4 U），经背部皮下不同点注射，1日2次，连续用4天。A组（-4d给药组）:从感染CVB 3m 的4天前（-4d）起给rhIL-6;B组（0d给药组）:从感染CVB 3m 的当天（0d）起给rhIL-6;C组（感染对照组）:从感染CVB 3m 的当天（0d）起，每日两次每次0.1ml无菌生理盐水经背部皮下不同点注射，
连续4天;D组（+4d给药组）:从感染CVB 3m 4天后（+4d）起给rhIL-6;E组（正常对照组，NC）:正常Balb/c小鼠;F组（正常给药组，N+IL-6）:正常Balb/c小鼠;与B组同时同法给rhIL-6。A、B、C、D组分别于感染后2、5、10天随机各取8只小鼠，留取血液及各脏器标本;E、F组分别于第5天和10天留取标本。
1.4 病理检查 心肌炎诊断标准及分级和胸腺继发萎缩的诊断及分度依据文献所述 ［10］ 。
1.5 小鼠心脏病毒滴度的检测 采用空斑形成实验。
1.6 统计学处理 本实验中计量资料结果均以均数±标准差表示，组间比较采用成组t检验，计数资料如病死率的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 心肌炎小鼠血清IL-6水平动态变化 小鼠感染CVB 3m 后第2天起，血清IL-6水平上升，第3天达高峰，7天回降至正常水平。其中第3天与正常对照比较差异有非常显著性（P<0.01）。正常对照组第3、7天的IL-6水平与感染组相比差异无显著性（P>0.05）。见图1。
图1 CVB3m感染鼠血清IL-6水平动态变化略
2.2 rIL-6干预后各组小鼠病死率比较 在整个观察期内，A组小鼠心肌炎症状较其余3组明显为轻。感染组小鼠自感染后第3天开始死亡，7～10天最多，观察至14天，A组小鼠死亡5只，病死率达12.5%;B组死亡18只，病死率为45%;C组共死亡22只，病死率为55.0%;D组共死亡20只，病死率为50%。A组病死率明显低于对照组C组，差异有非常显著性（P<0.01），B、D两组病死率也低于C组，但差异无显著性（P>0.05）。
E组正常对照小鼠及F组正常给药小鼠在整个观察期内无任何异常症状，无一死亡。见图2。
图2 rhIL-6干预实验各感染组小鼠病死率（+14d） 略
2.3 心脏病毒滴度比较 感染CVB 3m 第5天（+5d），通过空斑形成实验检测了A、B、C三组小鼠心脏病毒滴度，其中A组小鼠心脏病毒滴度明显低于C组（P<0.05）。见表1。
表1 +5d各感染组小鼠心脏病毒滴度（略）
2.4 各脏器病理改变的比较 各组小鼠的心脏、胸腺做常规病理切片，行HE染色，光镜下观察。
2.4.1 心肌组织病理 在rIL-6干预实验中，+5天各感染组均出现数量不等的局灶性小坏死灶，A、B组病理积分与C组比较差异无显著性（P>0.05）;+10天A组心肌坏死明显轻于C组，局灶性小坏死灶数目少于C组，大的坏死灶及弥漫性坏死少见，心肌病理积分明显低于C组差异有显著性（P<0.05）;B组和D组心肌坏死与淋巴细胞浸润较C组为轻，但心肌病理积分与C组相比差异无显著性（P>0.05），见表2。
表2 rIL-6干预实验中各组心肌病理积分比较（略）
2.4.2 胸腺 大体观察可见各感染组小鼠胸腺体积缩小，重量减轻。镜下观察A、B组多为轻度萎缩，C组多为重度萎缩，胸腺萎缩情况A、B组较C组为轻，见表3。
表3 +10d各感染组小鼠胸腺病理比较略
本实验中E组（NC）F组（N+IL-6）小鼠心肌及其他脏器病理检查均未见异常改变。
3 讨论
IL-6作为一种多效性炎性细胞因子，是参与免疫调节和炎症反应的重要细胞因子之一。为探明其在小鼠急性病毒性心肌炎中的作用，我们采用CVB 3m 感染小鼠诱发心肌炎模型，进而用rhIL-6进行了干预性研究，旨在为细胞因子IL-6能否在临床应用奠定实验基础。本实验发现，小鼠血清IL-6水平在感染CVB 3m 后第2天上升，第3天达高峰，第5天回降，第7天左右降至正常水平。国内学者用EMCV感染C3H小鼠诱发急性病毒性心肌炎，也发现血清IL-6水平在病毒性心肌炎的早期有明显上升和较快的回落，但各时相均提前 ［6］ 。Huber报道，Th 2 细胞是病毒感染时分泌IL-6的主要细胞，不同品系小鼠及不同的毒株T细胞的反应均不相同 ［7］ 。因此，病毒种类及动物种属不同可能影响血清IL-6的变化规律。本实验结果显示，血清IL-6水平的动态变化与病毒血症基本平行，而与心脏病理发展情况不相一致。提示，血清IL-6水平升高的主要因素是血液中病毒的存在和刺激，心脏局部浸润的炎性细胞数量对其影响不大。
关于IL-6在病毒性心肌炎动物模型中的作用，国内外均已有所报道，但多使用EMCV诱发的心肌炎模型进行研究。刘亚黎 ［6］ 用IL-6单克隆抗体中和EMCV性心肌炎小鼠体内的IL-6，发现心肌炎小鼠死亡率明显增加，心肌病变加重，提示IL-6在病毒性心肌炎中起保护作用。Kanda发现，rIL-6只有与病毒感染同时给予时，才起到保护作用，认为严格的时间窗限制其在临床应用的可能性。与Kanda的报道不同 ［5］ ，本研究用外源性IL-6干预CVB 3m 心肌炎小鼠时，发现感染病毒前给予IL-6可明显降低病死率和心脏病毒滴度，减轻心脏病理损伤和胸腺萎缩程度，感染前给予的效果优于感染同时给予，而感染后给予未见明显保护作用。
近年来，细胞免疫功能与病毒性心肌炎的关系受到广泛关注，大多数学者认为，病毒性心肌炎急性期存在细胞免疫功能的降低。体外实验证实 ［4］ ，IL-6不能直接杀死病毒，而是通过促进T、B细胞分化、成熟，激活巨噬细胞、NK细胞而间接消灭病毒。因此IL-6可能通过促进细胞免疫功能在病毒性心肌炎中起保护作用。提前给予IL-6明显降低了A组小鼠心脏病毒滴度及心肌病理损伤可能由于IL-6在病毒入侵以前对机体免疫系统的激活，有效抑制了感染初期病毒的复制和入侵心脏。而感染后给药可能错过了病毒血症的高峰期，对于已经进
入心肌细胞的病毒，IL-6可以通过激活CTL，促进心肌细胞表面CD54的表达和促进淋巴细胞粘附，引起心肌的免疫损伤 ［9］ 。另外，IL-6作为一种炎症因子对机体可能存在负面的影响，有报道提示IL-6与多种自身免疫性疾病有关 ［8］ 。本研究设立了F组（正常给药组），各器官病理检查未见异常，未发现外源性IL-6对健康小鼠有明显毒副作用。
IL-6作为重要的多效性免疫调节剂，已被用于临床治 疗肿瘤性疾病、促进放化疗后的免疫功能恢复及某些感染性疾病 ［3］ 。本研究显示，小鼠感染病毒前给予外源性IL-6可以改善心肌炎病情，感染后给予对心肌则无明显保护作用，提示IL-6对病毒性心肌炎具有一定的预防意义，治疗作用不明显。作为细胞因子网络中的重要一员，IL-6受多种因素影响，在病毒性心肌炎的不同时期其发挥的作用不同。如何选择恰当时机补充或清除体内的IL-6，使其发挥最佳效应，尚需大量的实验室及临床研究。
参考文献
1 Woodruff JF.Viral Myocarditis:A review.Am.J.Pathol1980，101:427.
2 Ramshaw lan A.，et al.Cytokines and immunity to viral infections.Imˉmun Reviews，1997，
159:119-135.
3 Revel M.Host defense against infections and inflammations:Role of the multifunctional IL-6/IFN-β2cytokine.Experimentia，1989，45:549-557.
4 Henke A，et al.Coxsackievirus B3induced production of tumor necrosis factor-α、IL-1、IL-6in human monocytes.J Immunology1992，148:2270-2277.
5 Kanda T，et al.Interliukin-6secreted from human myxoma reduces murine viral myocarditis.Life Sci1996，58（20）:1705-1712.
6 刘亚黎.白介素6在病毒性心肌炎发病中的作用.中华儿科杂志，1999，37（2）:101-103.
7 Huber SA，et al.Differences in cytolytic T cell response of BALB/c mice infected with myocarditic and non-myocarditic strains of coxsackievirus B，type3.Infect Immun，1983，39（3）:1419-1427.
8 Cox RA，et al.Production of tumor necrosis factor-alpha，interleukin-1，and interleukin-6during murine coccidiodomcosis.Infect Immun，1995，63（10）:4178-4180.
9 Nora R，et al.Absence of effects of cyclosporine on myocardial lymphoˉcyte subsets in coxsackievirus B3myocarditis in the aviremic stage.Cirˉculation Res，1989，934-945.
10 林久治.类固醇激素所致小鼠胸腺急性退缩的病理学观察.中华病理学杂志，1994，23（1）:29-30.
作者单位:100020北京首都儿科研究所
（收稿日期:2004-01-10） （编辑维 兰）