从噬菌体随机肽库中筛选IL-6抗体的识别表位

　　摘　要：目的：从噬菌体随机6肽文库中筛选IL-6抗体的识别表位。方法：利用具有IL-6中和活性的单抗C220筛选呈现于丝状噬菌体表面P3蛋白的随机6肽文库。结果:从噬菌体随机6肽文库中筛选出36株可与单抗特异结合的噬菌体克隆, 其中多数克隆呈现核心序列 SWLR，该序列与 IL-6 的序列具有一定同源性。竞争结合实验和Western印迹分析，带有 SWFNLR 和 HSWLRY小肽的2株噬菌体克隆可与IL-6竞争结合单抗C220。结论:SWFNLR 和 HSWLRY 是IL-6单抗C220特异识别的表位。

　　中国图书分类号：　R392.11

Selection of antigenic determinants recognized by neutralizing monoclonal antibody against IL-6 from a phage peptide library

CHEN Xing　 WANG Xin　YANG Zi-Yi et al

　　（Institute of Basic Medical Sciences , Academy of Military Medical Science, Beijing 100850 ）

　　Abstract：Objective： From a filamentious phage library displaying random hexapeptides，the authors selected clones displaying peptides that bind IL-6 monoclonal antibody.Methods:Selecting clones displaying peptides from a random hexapiptides library in phage display.Results:The selected peptides show a sequence motif SWLR that bears little resemblance to the primary sequence of IL-6 amino acid (residues 175～180 and residues 177～182 ) .The results of competition assay and Western blot confirmed that two sequences, SWFNLR and HSWLRY.Conclusion: SWFNLR and HSWLRY were antigenic determinants of IL-6.

　　Key words：Random peptides library　IL-6　McAb　Recognition epitope

　　由于重组的外源核苷酸序列呈随机排列，因此利用不同生物大分子作为亲合配体可从表达大量6肽的随机肽库中检出与之对应的6肽配基而无需事先知道配基的任何结构信息。本研究应用具有IL-6中和活性的单克隆抗体筛选编码6肽的随机肽库，以期从中检出与该单抗特异结合的6肽表位。

　　1　材料与方法

　　1.1　IL-6单抗　具有中和IL-6生物活性的单抗C220由本室自行研制［1］ 。

　　1.2　随机6肽文库　呈现于丝状噬菌体P3 蛋白的随机6肽文库由姚志建教授惠赠。

　　1.3　随机6肽文库的亲和筛选［2］　 噬菌体经扩增筛选，尽可能将与IL-6单抗特异结合的噬菌体富集。

　　1.4　测序　将亲和筛选所得噬菌体进行扩增和制备测序模板［2］，应用PE公司全自动DNA测序仪测序。

　　1.5　竞争结合实验［3］　按ELISA常规方法将IL-6单抗包被于96孔板，随后加入与IL-6预先保温的不同滴度的噬菌体克隆，在与单抗结合1 h 后，顺序加入噬菌体抗体、酶标二抗和酶反应底物。

　　1.6　Western 印迹分析　噬菌体颗粒经SDS-PAGE 分离并转至硝酸纤维膜,随后依次与IL-6单抗C220酶标二抗及显色底物反应, 至信号出现。

　　2　结果

　　2.1　与IL-6单抗结合的6肽序列的筛选　应用中和IL-6生物活性的单抗，对构建于丝状噬菌体P3蛋白的随机6肽文库进行亲和筛选。筛选5 轮后随机从中挑选36株克隆进行测序，并读出对应的氨基酸序列。其中，氨基酸序列为HSWLRT的克隆共有16株；序列为SWFNLR的克隆有14株；其余序列分别为RSQLVR、SDLWRY和DELLRI各2株。我们发现氨基酸序列为HSWLRY和SWFNLR的克隆出现频率较高，分别占总克隆的44.4%和38.8%，而且用IL-6单抗对随机6肽文库亲和筛选后，出现频率较多的克隆均具有氨基酸排列SWLR的核心序列，该序列与天然IL-6的氨基酸序列中的某些区域（175～180残基和177～182残基）具有50%的同源性。

　　2.2　具有SWLR核心序列的6肽与IL-6竞争结合IL-6单克隆抗体　为确证带有SWLR核心序列的6肽确实是IL-6单抗C220特异识别的表位，我们选择呈现核心序列SWLR的噬菌体克隆与IL-6进行竞争结合实验，并且以噬菌体6肽文库为阴性对照，结果表明，带有SWLR 表位的噬菌体与IL-6单抗结合的能力明显可被天然IL-6竞争抑制， 说明带有SWLR表位的噬菌体与IL-6竞争结合单抗C220上的同一位点，证明SWLR是由IL-6单抗C220特异识别的一个抗原表位。

　　2.3　Western 印迹　结果表明IL-6单抗仅与呈现SWLR表位的噬菌体克隆的P3蛋白有明显结合， 而与噬菌体文库中噬菌体颗粒的P3蛋白无阳性结合带，说明IL-6单抗仅与呈现SWLR表位的P3蛋白反应，而与文库中其他噬菌体克隆的P3蛋白无反应，进一步确证SWLR 为IL-6单抗C220特异识别的抗原表位。

　　3　讨论

　　目前已确定IL-6异常表达与多种疾病的发生相关［4-6］，针对此类疾病有多种治疗途径，其中包括应用IL-6中和抗体或应用IL-6拮抗剂以及IL-6受体拮抗剂进行治疗的方案，因此能够找到有效的具有中和IL-6生物活性的拮抗剂，对IL-6相关疾病的研究及治疗具有重要理论和实际意义。本实验应用一株具有中和IL-6生物活性的单克隆抗体为亲和配体，筛选呈现于丝状噬菌体P3蛋白的随机6肽文库，并获得一些呈现SWLR 核心序列的噬菌体克隆。该序列与IL-6一级序列（175～180和177～182 位氨基酸残基）具有一定同源性，实验结果证实， 该表位可与IL-6单抗特异结合而且它具有同天然IL-6 竞争结合IL-6单抗的能力，说明SWLR是由一株具有中和活性的IL-6 单抗特异识别的抗原表位，该小肽在体外和体内拮抗IL-6 生物活性的研究目前尚在进行中。