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Changes in TNF-αmRNA expression in electrical kindled epilepsy rat
Chen Xuqin，Wang Zhedong，Bao Guanshui，et al.
Affiliated Children’s Hospital of SoochowUniversity，Jiangsu，215000.
【Abstract】 Objective To study the expression of TNF-αmRNA in the basolateral amygdala electrical（BLA）kindled epilepsy rats.Methods Bipolar electrodes were implanted in BLA in rats，through which the rats reˉceived chronic electrical stimuli for kindling.Their seizure processes and behavior were observed，and electroencephaˉlogram（EEG）recording were performed during kindling and after kindled.At the end，hippocampi were extracted and TNF-αmRNA in hippocampi were analyzed with semi-quantitative RT-PCR.Results Mean stimuli needed for kindled was13.50±3.99.Their afterdischarge duration（ADD）was between21，450ms and119，720ms.Significantˉly upregulated expression of TNF-αmRNA was found in kindled rats.Conclusion In seizures induced by electrical kindling，TNF-αpossibly participate in the process of kindling.
Key words epilepsy kindling basolateral amygdala（BLA） tumor necrosis factor alpha（TNF-α）
虽然近年来对癫痫的发病机制进行了较多的研究，但其确切分子机制尚不清楚。有学者提出了“癫痫发病机制与神经—免疫—内分泌网络的调节失衡有关”的学说 ［1］ ，认为在癫痫的形成过程中有神经免疫机制参与。TNF-α是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，是参与神经、免疫功能的重要基础介质，在癫痫过程中作用越来越引起人们的重视。本实验通过观察电点燃癫痫大鼠海马中TNF-αmRNA表达水平的变化，从分子水平探索它在癫痫形成过程中可能发挥的作用。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及材料 电子刺激器（SEY-3201），脑立体定位仪（江湾Ⅰ型C），Cadwell视频脑电分析系统（Version1.70），PCR扩增仪（美国PERKIN ELMER公司），DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），Vilber凝胶成像分析系统仪（法国Lourmat公司）。
实验动物:SPF雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，体重180～280g，苏州大学实验动物中心提供，许可证号:SYXK（苏）2002-0037。所有大鼠在避强光、24h昼夜循环、避噪音、单笼、自由进食和饮水条件下饲养。随机分成空白对照组、手术对照组、癫痫组、托吡酯组共4组，每组6只。
1.2 电点燃动物模型的制作
1.2.1 电极插入 除空白对照组以外的所有大鼠以4%水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪，门齿比耳杆低2.4mm，按图谱 ［2］ 确定大鼠左侧杏仁基底外侧核（AP-2.0mm，ML5.0mm，VD8.0mm），将直径0.20mm的双极电极插入，电极位置在实验最后以组织切片证实。不锈钢螺丝钉固定于颅骨表面，再用牙托粉粘固。所有电极用导线连接于接插件。术后连续3日腹腔注射青霉素钠预防感染。大鼠术后恢复1周。
1.2.2 点燃过程 手术1周后，通过双极电极按下述参数每日1次刺激大鼠（空白对照组和手术对照组大鼠不予刺激）:400μA单相方波，波宽1ms，频率为50Hz，每次持续时间2s。观察发作强度，刺激30次以上仍未达到5级者，放弃刺激。发作强度按Racines法分级:0级:脑电图记录有发作波形，而没有抽搐动作;1级:静止、闭眼、胡须动、嗅、面部抽搐;2组:点头、咀嚼伴面部抽搐;3级:一侧前肢抬起、阵挛;4级:站立伴有双侧前肢阵挛;5级:站立、跌倒伴全身阵挛。大鼠连续5次出现5级反应即认为被点燃，停止刺激，进行下一步实验。
1.2.3 视频脑电图同步记录 Cadwell视频脑电分析系统同步记录大鼠自由状态背景脑电图和电刺激时的后发放时程（after discharge duration，ADD）。后发放（AD）是指电刺激后高幅多棘波痫样电活动至少确认5个以上。ADD是指从刺激结束到AD结束的这一段时间。
1.3 采集标本 灌胃结束再次电刺激后24h，所有实验大鼠麻醉后打开胸腔，主动脉弓穿刺，用PBS液冲洗大脑，然后打开颅腔，取大脑右侧海马组织并制成匀浆，移入Eppenˉdorf管中，置于-70℃冰箱保存备用。
1.4 海马组织中TNF-αmRNA的检测 半定量RT-PCR法检测海马组织的TNF-αmRNA表达，以β-actin为内参照。
1.4.1 PCR引物设计 β-actin引物（产物大小265bp）上游引物P 1 :5’-AGG CCG GCT TCG CGG GCG AC-3’，下游引物P 2 :5’-CTC GGG AGC CAC ACG CAG CTC-3’。
TNF-α引物（引物大小337bp）上游引物P 3 :5’-GCC AAT GGC ATG GAT CTC AAA G-3’，下游引物P 4 :5’-ACT TTG GAG TCA TTG CTC TG-3’。
1.4.2 海马组织中RNA提取 将保存的海马组织匀浆取1.5ml置于Eppendorf管中，加1ml TRIzol打匀后放入-20℃短期保存。标本在室温下融化后，加入0.2ml氯仿，12000r/min离心30min，然后把上层水相约500～600μl移入0.5ml异丙醇管中，振荡后置于-20℃冰箱10min，然后再离心15min，弃去上清液。RNA沉淀用70%、100%乙醇各洗1遍。在室温中干燥后，加入40μl预冷的DEPC（焦磷酸二乙酯溶液）溶解RNA，在紫外分光光度机上测定吸光度OD 260 ，计算RNA浓度。
1.4.3 逆转录生成cDNA 在PCR管中，先加入1μl6’-随机引物，再加入2μg RNA模板，70℃预变性5min。然后加入0.1M DTT4μl，10mM dNTP2μl，100U/ml RNAsin1μl，200U/ml M-MLV1μl，5×RT Buffer8μl，总反应体积40μl。然后放入PCR扩增仪，37℃反应60min，95℃灭活5min，4℃保存逆转录产物cDNA。
1.4.4 PCR过程（50μl体系） 总反应体积50μl，10×Buffer5μl，0.25mMMg 2+ 4μl，200μmol/L dNTP1μl，10pmol/μl P 1 1μl，10pmol/μl P 2 1μl，TaqDNA聚合酶0.4μl，cDNA5μl，H 2 O33μl。然后94℃预变性5min后开始下面30个循环:94℃变性30s;退火30s;72℃延伸1min;30个循环结束后，继续72℃延伸7min，终止反应。4℃保存扩增产物备用。其中退火温度扩增β-actin时为56℃，扩增TNF时为56℃。然后取上述各标本的PCR扩增产物，在琼脂糖凝胶中电泳，BioCaptMW分析系统测定扩增产物条带灰度值，以β-actin作为内参照确定TNF-α的mRNA表达水平。
1.5 数据处理 应用SPSS统计软件包进行数据统计处理，实验数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，计量资料多组间均数比较在确定方差齐性后采用F检验（One-Way ANOVA过程），两两比较采用SNK（Student-Newman-Keuls）法。计数资料采用行列表确切概率法（Fisher Test）检验。
2 结果
2.1 点燃杏仁基底外侧核的过程及脑电图分析 点燃过程最快的7天，最慢的19天，平均（13.50±3.99）天达到点燃。点燃大鼠记录到后发放时程在（21，450～119，720）ms之间，上述结果与文献报道相一致 ［3］。
2.2 癫痫海马组织中TNF-αmRNA的表达改变 见表1、图1。
表1 各组TNF-α测定结果（略）
注:与对照组比较， ˇ P<0.05。
结果如图1和表1所示，各组海马TNF-αmRNA的表达差异有显著性（P<0.05），两两比较发现癫痫组海马TNF-αmRNA的表达较对照组明显升高，与两个对照组相比P<0.05，差异有显著性，而两个对照组之间TNF-αmRNA的表达差异无显著性。这结果说明TNF-α与癫痫过程有关。
3 讨论
有关实验性癫痫的研究，国内目前多采用全身或局部药物致癫痫持续状态（SE）模型，点燃模型在国外作为颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）模型广泛用于癫痫的研究，以及抗癫痫药临床前期的评估。因为电点燃引起的自发性边缘系统癫痫与人类颞叶癫痫在症状学、神经病理学和行为学缺陷等方面均很相似 ［4］，且能避免化学药物对神经元的直接毒性作用，抽搐发作易于控制，病死率低，故较药物致痫模型具有显著优点。
有关TNF-α和与癫痫的关系近年国内外已有所报道，大量临床观察和实验研究表明，TNF-α在癫痫过程中高水平表达，在癫痫中发挥重要作用，但其具体作用机制不十分清楚。TNF-α主要由单核（巨噬）细胞产生，正常情况下，外周巨噬细胞分泌的TNF-α不能通过血脑屏障进入中枢神经系统，但在癫痫等中枢神经系统疾病过程中，由于血脑屏障受损，它们可以进入中枢神经系统（CNS）。此外，CNS疾病过程中，TNF-α可由脑组织局部的小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元细胞或浸润的淋巴细胞产生。另一方面，中枢神经系统内各类组织细胞表面也广泛表达各种细胞因子受体如:IL-6R、TNF-αR等，因此，TNF-α可通过与相应受体结合而影响CNS功能，并参与某些CNS疾病的发生。TNF-R有TNFR-I（55kd）和TNFR-Ⅱ（75kd）两型，活性主要由TNFR-I介导。TNF-α与TNFR-I结合激活NF-KB通路，诱导促炎细胞因子、趋化因子、粘附分子以及对细胞具有保护作用的蛋白质的表达，而在蛋白合成受抑的情况下，TNF-α则触发细胞凋亡。脑内TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子主要由小胶质细胞和星形胶质细胞产生，癫痫持续状态（SE）以年龄依赖性方式激活小胶质细胞、星形胶质细胞以及细胞因子的神经合成。海仁藻诱发的SE动物模型中，有人发现TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的合成先于神经元损伤出现，海马神经元损伤只出现于细胞因子被诱导之后，这结果提示前炎性因子促使SE诱导的海马损伤 ［5］ 。关于点燃模型中癫痫形成和免疫系统之间关系的研究发现，TNF-α预处理组大鼠较对照组出现较长时间的痫样放电，β和γ波增多，而δ波减少，反复电刺激明显增加血清和脑组织TNF-α水平，由此说明癫痫形成和细胞因子产生机制有相互促进作用 ［6］ 。用TNF-α刺激的星形细胞条件培养液对细胞神经元进行培养，可使神经元释放谷氨酸增加 ［7］ ;将此培养液注入健康大鼠的侧脑室可诱发癫痫。预先用TNF-α反义寡核苷酸阻断TNF-α的合成，再用马桑内酯刺激的星形胶质细胞培养液注入健康大鼠侧脑室，则不能诱发癫痫［8］ 。上述现象证实TNF-α确实能致痫。本实验结果显示，癫痫组大鼠海马TNF-αmRNA表达明显高于对照组，与上述文献报道一致，提示TNF-α在癫痫的免疫学发病机制中发挥一定的作用。
TNF-α参与癫痫形成的可能机制有:（1）TNF-α使兴奋性氨基酸（谷氨酸）活性增强，而抑制性氨基酸（γ-氨基丁酸）活性减弱。TNF-α抑制胶质细胞内谷氨酰合成酶活性和抑制谷氨酸的转化，或抑制星形胶质细胞谷氨酸转运体的活性而降低谷氨酸的吸收，从而使谷氨酸量增加，促使N-甲基-D-天门冬氨酸盐（NMDA）受体的激活。国内星形胶质细胞培养实验亦证实，TNF-α可使胞内谷氨酸量升高并促进其释放 ［9］ 。有文献报道，脑内TNF-α能降低钾离子所激发的GABA的释放 ［10］ 。（2）TNF-α刺激胶质细胞增生，对胶质细胞显示毒性作用，如影响离子通道介导体外培养的胶质细胞坏死，使神经元脱髓鞘等。（3）TNF-α还可诱导增生的胶质细胞产生其他的细胞因子如IL-6、IL-2、GM-CSF等和相应的受体，参与癫痫等中枢神经系统疾病的发生和发展。
TNF-α对人脑神经元细胞起保护作用。TNF-α保护大鼠胚胎海马、皮层神经元遭受兴奋性氨基酸的损害，其机制可能是:（1）通过诱导钙调蛋白（calbindin-D28K）和氧自由基抑制因子Mn-SOD上调，以维持Ca 2+ 动态平衡等 ［11］ 。（2）TNF-α与TNF-αR-1结合导致NF-κB活化，后者刺激抗凋亡基因（如XIAP、HIAP-1）的产生而阻断TNF-α诱导的神经元死亡。（3）TNF-α活化NF-κB后，后者通过抑制异性谷氨酸受体亚基的表达，而减弱神经元对谷氨酸的敏感性 ［12］ 。
TNF-α作为一个重要的免疫介质，在癫痫中起着重要作用，但对其作用机制的研究有待进一步深入，以期为癫痫的治疗和预防开辟一条新途径。
（致谢:本实验动物实验部分在苏州大学医学院神经生物学研究室印其章教授和龚珊老师的指导下完成，在此表示衷心的感谢）。
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作者单位:215003苏州大学附属儿童医院
201900上海第二医科大学附属宝钢医院神经内科
214002江苏省无锡市儿童医院