点击显示 收起
【Abstract】 Objective To study the effects of QianKunNing（QKN）prescription on the life quality and im-mune function of tumor-bearing mice.Methods Experimentally implanted tumor model was made by subcutaneous injection of H22hepatic carcinoma cells，life quality was scored，body weight，spleen index and thyme index were measured.The effect of the drug on ear swelling was examined in delayed-type hypersensitivity（DTH）induced by allergen2，4-initrochlorobenzene.The level of IFN-γand TNF-αin the serum of tumor bearing mice was tested by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Spleen lymphocytes were isolated from QKN treated model mice，ConA stimulated proliferation was tested byMTT assay.Results Life quality of tumor bearing mice was improved sig-nificantly in QKN treated group;body weight and immune organs were almost unchanged or showed certain degree of improvement，which exhibited great advantage over5-FU，a common used chemotherapeutic agent.Ear swelling was significantly enhanced after treatment of QKN at the dose of1g/kg and3g/kg.QKN could also notably raise the level of cytokines in the serum of tumor bearing mice.Lymphocyte proliferation induced by ConA was significantly improved in QKN treated group at the dose of2g/kg.Conclusion QKN prescription could improve and recover the immune function of tumor bearing animals，and have the advantage of improving life quality and little toxicity over chemothera-peutic agents.
【Key words】 QianKunNing life quality delayed type hypersensitivity cell factor lymphocyte proliferation
乾坤宁是依据扶正祛邪、清热利湿、益气养阴、消积散结的中医理论，以茵陈、黄芪、茯苓、三棱、莪术、五倍子等组方而成的抗肿瘤中药复方制剂。前期研究结果表明，乾坤宁在体外对多种肿瘤细胞的生长增殖有浓度依赖性的抑制作用，动物实验发现，乾坤宁体内对小鼠H22肝癌、小鼠B16黑色素瘤、小鼠Lewis肺癌均有显著的抑瘤效果（待发表）。在以上研究的基础上，本文旨在从中药“扶正”的角度来探讨药物对荷瘤小鼠生存质量及免疫功能的影响。
1 实验材料
1.1 药物 乾坤宁浸膏粉:由四川恩威中医药研究开发有限公司中试室提供，批号20031001。使用时以生理盐水配成不同浓度的混悬液。氟尿嘧啶（5-FU）注射液:天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0303271。无菌生理盐水:四川科伦大药厂有限责任公司生产，批号B030502-07。
1.2 实验动物 昆明种小鼠，体重18～22g，单一性别。由四川省抗菌素研究所实验动物中心提供，动物生产合格证:川实动质第99-31号。
1.3 肿瘤细胞 小鼠肝癌腹水型H22肿瘤细胞，由华西医科大学肿瘤研究所提供。经小鼠腹腔接种传代，液氮冻存。
1.4 主要试剂 2，4-二硝基氯苯，上海试剂一厂生产，批号2000-01-01。刀豆蛋白A（ConA），MTT均为sigma公司产品。小鼠IL-2ELISA试剂盒，小鼠TNF-αELISA试剂盒，小鼠IFN-γELISA试剂盒均为晶美公司进口分装。
2 实验方法
2.1 小鼠肿瘤移植模型的制作 ［1］ 取荷腹水瘤小鼠，消毒腹部，无菌抽取腹腔液，1000rpm离心5min，弃去上清，生理盐水洗2次，台盼蓝排斥法计数活细胞数目。以生理盐水配成1×10 7 细胞/ml细胞悬液，小鼠右侧腋下皮下注射0.2ml/只。肿瘤接种后7天左右，可见明显的瘤块形成。
2.2 乾坤宁对荷瘤小鼠一般状态及免疫器官的影响 小鼠H22肿瘤移植模型制作如2.1所述，小鼠皮下接种第2天，将其按体重随机分为5组，乾坤宁高中低剂量组分别按3g/kg，2g/kg，1g/kg灌胃给予相应浓度的药物混悬液。每天1次，连续10天;氟尿嘧啶（5-FU）组按20mg/kg剂量腹腔注射，每天1次，连续7天。对照组连续10天灌胃给予相同体积的生理盐水。末次给药后第2天，小鼠称重，比较用药前后体重变化;按如下标准进行生存质量评分;脱颈椎杀鼠，分离脾脏、胸腺，称重，计算脾指数和胸腺指数。生存质量评分标准如下:
4分:毛色光亮、顺滑;体态匀称，运动灵活;两眼明亮有神，反应灵敏;基本无肿瘤生长或者肿瘤较小，对小鼠各项生理活动无明显影响。
3分:毛色顺滑，光亮或稍发暗;运动较灵活或稍显迟缓;两眼有神，反应灵敏;肿瘤较大，但仅对小鼠运动稍有影响，对呼吸、精神等基本生命活动无明显影响。
2分:毛凌乱，发暗;或体质虚弱或瘦小;运动迟缓，精神状态差;肿瘤大，明显影响运动及精神状态，但无明显的呼吸困难等严重病理表现。
1分:毛色凌乱;体质虚弱或瘦小;行动十分迟缓困难，精神状态极差，无神，蜷缩不好动;肿瘤很大，严重影响其基本的生命活动，出现明显呼吸困难，眼球外突、精神抑郁等严重病理表现。
0分:死亡，仅包括因肿瘤过度生长所致的死亡。即在死亡前有肿瘤过度增长，严重影响生命活动现象。前期肿瘤未长出之前所出现的死亡、有明显其他意外原因造成死亡排除在外。
2.3 乾坤宁对荷瘤小鼠迟发型超敏反应（DTH）的影响 ［2］ 小鼠H22肿瘤移植模型制作如前所述，同时设不接种肿瘤的正常对照组。移植小鼠皮下接种第2天，将其按体重随机分为4组，乾坤宁高中低剂量组分别按3g/kg，2g/kg，1g/kg灌胃给予相应浓度的乾坤宁混悬液。每天1次，连续7天;模型对照组和正常对照组连续7天灌胃给予相同体积的生理盐水。给药至第3天时，小鼠腹部脱毛，涂2%氯苯的无水乙醇溶液致敏，末次给药后当天，以20μl2%的氯苯橄榄油溶液涂右耳壳，18h后，将小鼠处死，用直径8mm 打耳器在双耳相同部分打下圆形耳片。称重，以左右两耳的重量差表示耳廓的肿胀度。
2.4 乾坤宁对荷瘤小鼠细胞因子的影响 小鼠H22肿瘤移植模型制作如2.1所述，皮下接种第2天，将小鼠其按体重随机分为5组，乾坤宁高中低剂量组分别按3g/kg，2g/kg，1g/kg灌胃给予相应浓度的乾坤宁混悬液。每天1次，连续10天;对照组连续10天灌胃给予相同体积的生理盐水。末次给药后第2天，将小鼠断头处死，分离血清，-20℃冻存血清中细胞因子含量的测定按试剂盒说明书进行。
2.5 乾坤宁对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 ［2］ 小鼠H22肿瘤移植模型制作如前所述，模型小鼠分为4组，分别为乾坤宁低、中、高剂量组和模型对照组，另外设不接种肿瘤的正常对照组。乾坤宁各组按1g/kg、2g/kg、3g/kg灌胃给予乾坤宁混悬液，模型对照和正常对照均给予生理盐水，连续7天。
末次给药后第2天，脱颈椎杀鼠，无菌分离脾脏，研磨，吹打，使之成为单个细胞。以8层纱布过滤后离心。弃上清，加入Tris-NH 4 Cl冰浴孵育5～10min。离心，以PBS洗2次后以RPMI-1640+10%小牛血清配成浓度为5×10 6 /ml细胞悬液。
将脾淋巴细胞接种于96孔培养板内，同时加入ConA，使其终浓度为10μg/ml。同时各组分别设不加ConA的对照组。37℃4.5%CO 2 培养72h。加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4h，吸弃上清，加入200μl二甲基亚砜。振荡10min后，于酶联免疫检测仪上测定OD540。以ConA刺激孔的OD值减去相应未加ConA孔的OD值所得数值代表ConA所引起的淋巴细胞增殖状况。
2.6 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，对生存质量评分进行秩和检验;对其它指标采用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA）进行统计学检验。
3 实验结果
3.1 乾坤宁对荷瘤小鼠一般状态及免疫器官的影响 实验结果表明，乾坤宁各剂量组荷瘤小鼠连续给药10天后，其体重增长与生理盐水对照组相比基本无差别或有一定的提高的趋势。但是，阳性对照5-FU腹腔注射7天后，小鼠体重增长显著低于对照组（P<0.05）。乾坤宁对荷瘤小鼠的生存质量也有明显提高作用，其中低剂量生存质量评分与生理盐水对照组差异有显著性（P<0.05）。而阳性对照药5-FU生存质量评分显著低于对照组。中药各剂量组在生存质量上也均显著高于阳性对照药5-FU组（P<0.01）。
表1 乾坤宁对荷瘤小鼠一般生存质量及免疫器官的影响略
在脾指数和胸腺指数上，乾坤宁各剂量组与生理盐水 组差异均无显著性（P>0.05）;阳性对照药5-FU组则均显著低于生理盐水组（P<0.01或P<0.05）;中药乾坤宁各剂量组与阳性对照药相比，脾指数和胸腺指数均有显著性提高（P<0.01或P<0.05）。
3.2 乾坤宁对荷瘤小鼠DTH的影响 研究结果表明，肿瘤模型组小鼠耳肿胀显著低于正常对照组小鼠，荷瘤小鼠连续7天给予乾坤宁后，其DTH耳肿胀较模型组有明显提高，基本恢复到正常小鼠水平，其中在1g/kg和3g/kg与模型对照组差异有显著性（见表2）。
表2 乾坤宁对荷瘤小鼠DTH耳肿胀的影响略
3.3 乾坤宁对荷瘤小鼠细胞因子的影响 乾坤宁各剂量组小鼠血清IFN-γ水平均明显高于模型对照组，在1g/kg和2g/kg剂量与对照组差异有显著性。乾坤宁高剂量也能极显著提高荷瘤小鼠血清的TNF-α水平（P<0.01）。但是，乾坤宁各组和模型对照组小鼠血清中的IL-2水平均在检测限以下（数据未列出）。
表3 乾坤宁对荷瘤小鼠细胞因子的影响略
3.4 乾坤宁对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 如图1所示，乾坤宁2g/kg连续给药7天后，小鼠脾淋巴细胞在ConA的刺激下的增殖能力显著高于模型对照组。
图1 乾坤宁对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响略
4 讨论
前期研究表明，依据扶正祛邪、消积散结的中医理论组方的中药复方乾坤宁对多种动物移植性肿瘤均有显著的抑 制效果（待发表），本研究则进一步发现，乾坤宁在提高荷瘤小鼠生存状态方面明显优于化疗药物:化疗药表现出明显的全身毒性，无论在体重增长、生存质量，还是在脾脏指数和胸腺指数方面，5-FU组均显著低于生理盐水对照组;而相比之下，中药乾坤宁各组各指标与对照组无明显差别或有一定改善的趋势。中药各组在以上各项指标与化疗药相比差异均有显著性。这表明，中药复方在抑瘤的同时，具有毒性小、能够改善动物荷瘤生存质量的优势。
机体的免疫功能在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用，在抗肿瘤免疫中，由T细胞介导的细胞免疫功能发挥着主要作用，由硝基氯苯致敏后再进行耳部攻击造成的小鼠耳肿胀是一种典型的迟发型超敏反应（delayed-type hyper-sensitivitiy，DTH），这种反应主要是有T淋巴细胞功能介导的 ［2］ ，小鼠耳肿胀的程度可以较好地反应体内T细胞免疫的状态。本研究结果显示，荷瘤小鼠T细胞免疫功能显著降低（与正常小鼠相比，P<0.05），而服用乾坤宁对细胞免疫有明显的提高恢复作用（见表2）。
细胞因子是由免疫细胞产生的一类小分子免疫调节物质，他们在抗肿瘤免疫中发挥重要作用 ［3］ 。γ干扰素（IFN-γ）主要由活化的T细胞和NK细胞产生的，它不但可以直接抑制肿瘤细胞的增殖，而且具有广泛的免疫调节作用，能够激活和促进单核巨噬细胞以及NK细胞的吞噬作用;促进T细胞和B细胞的分化和成熟，刺激B细胞产生抗体，增强杀伤性T细胞（CTL）介导的细胞毒作用。同时，它还可以诱导肿瘤细胞表达MHC-1类抗原，从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别。目前，IFN-γ已被临床应用于淋巴瘤、皮肤瘤等的治疗。肿瘤坏死因子α（TNF-α）在体内主要由活化的巨噬细胞产生，是一种可以直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子。同时，它对白细胞和淋巴细胞的功能也有一定的调节作用。目前也已被临床用于局部注射治疗肿瘤。本实验发现，乾坤宁可以显著提高荷瘤小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平，这表明，乾坤宁可以通过促进抗肿瘤细胞因子的分泌达到抑制肿瘤的效果。
刀豆蛋白A（ConA）是一种丝裂原，它可以刺激T淋巴细胞发生增殖和分化，这一过程与体内T淋巴细胞的活化过程相似，因此，ConA诱导的淋巴细胞增殖常被用来作为评价T淋巴细胞功能的指标 ［2］ 。本实验发现，乾坤宁2g/kg使小鼠淋巴细胞转化能力明显增高，与模型对照组有显著差异，这表明，乾坤宁体内给药可以促进荷瘤小鼠的淋巴细胞增殖。
综上所述，乾坤宁可以改善小鼠一般生存状态、增强ConA诱导的淋巴细胞增殖、提高细胞因子水平、使荷瘤小鼠低下的DTH反应得到提高和恢复。这不仅可能是药物抑瘤作用的重要机制，而且充分体现了中药复方在肿瘤治疗方面的优势。
参考文献
1 韩锐.抗癌药物研究与实验技术，北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997，295-299.
2 徐叔云.药理实验方法学，第2版.北京:人民卫生出版社，1991，92.
3 毕爱华，龚非力.医学免疫学，北京:人民军医出版社，1995，60-79.
作者单位:1 610041四川成都恩威中医药研究开发有限公司
2 210093南京大学生命科学学院