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【Abstract】 RNA interference（RNAi）in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient origin.RNAi is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-strand-ed RNA（dsRNA）.The discovery of RNAi and the molecular mechanismwill help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug.
【Key words】 RNA interference（RNAi） small interfering RNA（siRNA） double-stranded RNA（dsRNA） RNA-induced si-lencing complex（RISC） Argonaute pol III
1 背景
20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个发现:Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，Jor-gensen将这种现象命名为协同抑制（cosuppression）。在真菌中也有类似的现象，1996年就在脉孢菌属（Neurospora）发现这种现象。当时将这种现象命名为基因表答的阻抑作用（quelling） ［1］ 。通过对转基因植物的研究，发现相应基因的转录并不受影响，将这种现象称为基因转录后沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。转录后的基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子和RNA病毒的防御机制，可能在植物和动物分化之前就已经出现。1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次将双链dsRNA（double-stranded RNA）注入线虫，结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默。将这种由dsRNA（double-stranded RNA）引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用（RNA interference RNAi） ［2］ 。
2 RNAi的分子机制
dsRNA（double-stranded RNA）可以介导基因沉默作用，以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点。dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子。哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA（dsRNA），其一是特异性路径:特殊dsRNA的序列用于RNAi，起始阶段dsRNA被切成siRNA（small interfering RNA或short interfering RNAs）。siR-NA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子，能提供一定的信息，允许一个特定的mRNA被降解。siRNA正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，再每条链的3'端都有2个不配对的碱基（图1）。
图1 siRNA
另一条是非特异性路径:只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA，抑制所有蛋白质的合成。长的dsR-NA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子，导致翻译抑制。也可以通过激活2'-5'AS合成一个分子激活RNase L，导致非特异的RNA降解 ［3］ 。关于特异性的RNA作用机制模型，包括起始阶段和效应阶段 ［4］ 。起始阶段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，属内切核酸酶）的作用下加工裂解21-23核甘酸长的小分子干扰RNA片断（siRNA） ［5］ 。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。在RNAi的效应阶段，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物（RNA-induced silencing complex or RISC），在siRNA解双链即RISC激活过程需一个ATP ［5］ 。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合，随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达。RISC由多种蛋白成分组成，包括核酸酶，解旋酶和同源RNA链搜索活性等。最新研究表明，Argonaute蛋白为RISC的特有成分，被比喻成“切薄片的机器”。onaute有一个月牙型的底座由三部分组成，分别为N-端（amino-terminal）、中部（middle）和PIWI区域（PIWI domain）。在月牙底座上面有一个PAZ部分，由茎杆结构支撑。Argonature蛋白有一个明显的凹槽贯穿整个蛋白，凹槽内壁带正电有利于与RNA带负电的磷酸骨架结合。siRNA解旋后，siRNA单链的3'端伸入PAZ的裂缝中，整个单链沿着PAZ伸展开，同时目的片段mRNA结合于新月型底座。mRNA与siRNA互相配对形成双链后，在离单链siRNA5'端9个碱基处（即离siRNA3'端11-12个碱基处）切割mRNA（图2） ［6］ 。
图2 siRNA引导mRNA被切割的模型3 siRNA的表达
最便利的siRNA表达载体用三种RNA聚合酶III启动子（pol III）中的一种（Sui2002，Lee2002，Paul2002），操纵一段小的发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）在哺乳动物细胞中的表达（图3） ［7］ 。
图3 hairpin siRNA
这类启动子有大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子 ［8］ 。采用RNA pol III启动子是因为它结构简单，而且可在哺乳动物细胞中表达小分子RNA，并且它可通过一串（3-6个）U来终止转录的，这刚好符合原始设计的siRNA的3'端含有2个突出碱基U（Elbashir2002）。使用这类载体，首先要设计2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，然后订购这2段DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III启动子下游。克隆可能要几周甚至数月的时间，为保证克隆的序列的正确性，还要进行测序。 病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞并维持较长时间的基因沉默 ［9］ 。siRNA目标位点的筛选是实现RNAi作用的关键，一般有以下几个原则 ［10，11］ :（1）在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列，起始是AA;（2）找2～4个小片段的RNA，通过SECs（siRNA expression cassettes，SECs）筛选最有效的siRNA;（3）在19nt的RNA片断中不能含有连续4个T或A的区域;（4）通过BLAST确定片断的特异性;（5）片断GC%应该在30%～50%。
4 RNAi的应用前景
4.1 研究信号传导通路和基因功能 RNAi能够在哺乳动物中降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间，控制基因表达的部位。
4.2 开展基因治疗的新途径 一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因表达同时降低的表现，也可同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。为治疗多基因调控的肿瘤疾病，带来新的治疗策略。
参考文献
1 Isolation of quelling-defective（qde）mutants impaired in posttran-scriptional transgene-induced gene silencing in Neurospora crassaProc.Natl Acad Sci USA，1997，94:10233-10238.
2 Fire A，Xu S，MontgomeryMK，et al.Potent and specific genetic inter-ferenceby double-strand RNA in coenorhabditis elegans.Nature，1998，391（6669）:744-745.
3 Nature，2001，411，428-429.
4 Matzke.M，Matzke A J，Kooter JM.RNA:guiding gene silencing.Sci-ence，2001，293（5532）:1080-1083.
5 Nykanen A，Haley B，Zamore P D.ATP requirements and small interfer-ing RNA structure in the RNA interference pathway.Cell，2001，107（3）:309-3021.
6 Ji-Joon Song，Stephanie K.Smith Gregory J.Hannon，1Leemor Joshua-Tor1，2*3Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity SCIENCE，2004，305.
7 Yu J.-Y.，DeRuiter S.L.，Turner，D.L.RNA interference by ex-pression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（9）:6047-6052.
8 Miyagishi M，Taira K.U6promoter-driven siRNAs with four uridine3'overhangs effectively suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnology，2002，20:497-500.
9 Gustavo Tiscornia，Oded Singer，Masahito Ikawa，et al.A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors expressing small interfering RNA Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（4）:1844-1848.
10 Brown D，Jarvis R，Pallotta V，et al.RNA interference in mammalian cell culture:design，execution，and analysis of the siRNA effect.Ambion TechNotes9（1）:3-5.
11 Sui G，Soohoo C，Affar EB，et al.A DNA vector-based RNAi tech-nology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci.US A，2002，99（8）:5515-5520.
作者单位:350007福建师范大学生物工程学院发育生物学研究室