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Antiproliferation effects of polysaccharides from spirulina platensis on HepG-2cells
Yan Bomin，Yu Hong
Department of General Surgery，Wanjie Hospital，Qingdao266071.
【Abstract】 Objective To investigate the antiproliferation effects of polysaccharide from spirulina platensis（PSP）on HepG-2cells.Methods The antiproliferation activities of PSP were evaluated on HepG-2cells by MTT assay.The morphological changes were observed under light microscope.Cell division cycle was measured by flow cy-tometry.Results MTT assay showed that with the increase of PSP concentrations，the inhibited rate on HepG-2cells increased and the survived rate declined;HepG-2cells exposed to PSP for24-48h displayed significant mor-phological changes;PSP had a specific effect on the HepG-2cell division cycle，increased the number of cells in phase G 1 .Conclusion In vitro，PSP exerts direct inhibitory effect on HepG-2cells.
【Key words】 polysaccharide from spirulina platensis hepG-2cells cell division cycle
螺旋藻是一种微藻类古老生物，属蓝藻门、蓝藻纲、颤藻目、颤藻科、螺旋藻属。螺旋藻多糖（polysaccharide from spirulina platensis，PSP）是从螺旋藻中提取的1种水溶性多糖类化合物，实验证明螺旋藻多糖具有抗衰老、降血脂、促进蛋白质合成、提高免疫力、抗辐射等多种生物功能 ［1，2］ 。近年来研究报道螺旋藻多糖具有良好的抗肿瘤作用 ［3，4］ 。由于它为天然化合物，具有无毒、高效的特点，明显不同于常用细胞毒类抗肿瘤药物，因此，其研究与开发已成为目前国内外海洋药物的热点之一。本实验研究了钝顶螺旋藻多糖对人肝癌细胞株HepG-2细胞的体外抑制作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和药物 螺旋藻多糖，采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取 ［5，6］ ，纯度90%以上。RPMI-1640干粉培养基为美国Gibco公司产品;胰酶为Amersco公司产品;四甲基偶氮唑盐（MTT）为Sigma公司产品;96孔培养板为Coster公司产品。
1.2 细胞及细胞培养 人肝癌细胞株HepG-2细胞购自上海细胞生物研究所，于RPMI-1640基础培养液中加入10%的新生牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，置37℃、5%CO 2 孵箱中培养，3～4天传代1次。人二倍体成纤维细胞传代培养同HepG-2细胞。
1.3 HepG-2细胞生长抑制试验 采用MTT比色法，取对数生长期的HepG-2细胞，胰酶消化后以含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，加入96孔培养板中，24～48h后加入不同稀释度的PSP，并以阿霉素（20mg/L）作阳性对照，正常人二倍体成纤维细胞作阴性对照，每个浓度设6个复孔，置37℃、5%CO 2 孵箱中连续培养72h，培养结束前4h，每孔加入MTT20μl，37℃培养箱中培养4h，离心弃上清后每孔加二甲基亚砜，微量振荡器振荡，自动酶标读数仪比色（波长570nm），测吸光度并计算药物对HepG-2细胞的抑制率。HepG-2细胞存活率=抗癌药物组吸光度值/细胞对照组吸光度值×100%，抑制率=100%-存活率。
1.4 HepG-2细胞形态学观察 细胞接种在放有飞片的培养瓶中培养，待细胞生长至对数期，加入不同稀释度的PSP，定时在倒置显微镜下直接观察;同时取经PSP作用的飞片，1:3冰醋酸:甲醇固定30min，常规HE染色，镜下观察。
1.5 HepG-2细胞周期测定 ［7］ 培养细胞制成单细胞悬液，细胞数约10 6 个/ml，同时设不加PSP的肿瘤细胞对照组和PSP作用48h和72h的实验组。用PBS液洗2次，轻轻打匀细胞，预冷的75%酒精（1～3ml）固定，加入碘化丙啶，置4℃避光染色30min，400目尼龙网过滤后，将样品加入流式细胞仪的样品室，以激发波长488nm测定，微机统计分析资料，输出结果。
2 结果
2.1 PSP对HepG-2细胞生长的抑制作用 HepG-2细胞经2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的PSP作用48h及72h，结果显示，随药物浓度及培养时间的增加，细胞存活率逐渐降低，抑制率逐渐增加，以PSP（40mg/L）作用72h最为显著，而上述各浓度组PSP对人二倍体成纤维细胞无明显作用（见图1）。
图1 PSP对HepG-2细胞生长的抑制作用
2.2 HepG-2细胞的形态学变化 不同浓度的PSP（2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L）处理HepG-2细胞24～48h，HE染色显示，部分细胞体积明显缩小，细胞膜完整并出现小泡，胞浆变少，细胞核明显固缩，染色质浓染，72h上述改变明显。未加PSP的HepG-2细胞改变不明显，仅见散在的细胞质红染、核固缩的细胞。
2.3 PSP对HepG-2细胞周期的影响 流式细胞仪分别观察未加PSP的HepG-2细胞对照组和加10mg/L、40mg/L的PSP作用48h各实验组细胞周期的变化，发现PSP作用组G 0 ～G 1 期细胞百分数增高，表明细胞发生G 1 期阻滞（见表1）。
表1 PSP对HepG-2细胞周期的影响 （略）
3 讨论
螺旋藻已被用于恶性肿瘤的治疗，并取得一定的疗效，现认为螺旋藻及其多糖在动物实验中有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数，增加外周血液中T淋巴细胞的百分数和血清溶血素的含量，对正常小鼠骨髓细胞有促增殖作用，并有明显的抗癌与抗辐射作用 ［8～10］ ，但对肿瘤细胞DNA和蛋白质的抑制作用，报道结果差异较大，还需进一步证实。 本实验应用MTT法研究了PSP对HepG-2细胞的生长影响，以PSP10mg/L时即有较明显的抑瘤作用，并有剂量效应关系，同样条件下对正常人二倍体成纤维细胞无影响;光镜下观察显示，PSP作用24～48h后，细胞出现明显的形态学改变，这可能是其对细胞的直接损伤所致;流式细胞仪分析受药物作用后的细胞周期DNA变化表明，PSP对肿瘤细胞存在周期特异性，能使细胞DNA损伤，发生G 0 ～G 1 期阻滞。说明PSP对HepG-2细胞的直接杀伤或抑制起主要作用。目前临床肿瘤的放射治疗和化学治疗都存在着抑制机体免疫功能等严重的毒副作用，而PSP在具有良好抑瘤效果的同时，不伴有明显的毒副作用，还能治疗或预防肿瘤病人化疗和放疗过程中对正常细胞的损伤 ［11，12］ ，显然，这种独特的双重作用有利于肿瘤病人的综合治疗和康复，适于联合用药。因此，PSP作为一种高效、低毒的抗肿瘤药物，在免疫化疗中具有相当好的应用前景。
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作者单位:266071山东青岛青岛万杰医院普外科
266021山东青岛青岛大学医学院微生物学教研室