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Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan430064，China
【Abstract】 Objective To observe the effect of Shenma injection on antioxidative ability of cardiomyocytes after a-cute ischemia-reperfusion in rats.Methods The ischemia-reperfusion heart model was established by ligating/loosening the left anterior descending branch of coronary artery in Wistar rats.The activitie of cNOS，GSH-Px，SOD and the content of MDA，in the myocardium and CK activity of serum were examined.Results The activitie of cNOS，GSH-Px，SOD was increased significantly in the Shenma group as compared with that of ischemia-reperfu-sion group（P<0.01）.CK，iNOS activity and MDA content were decreased significantly in the Shenma group.Con-clusion The results suggested that the protected effects of Shenma injection on the myocardial ischemia-reperfusion injury may be reiated to its actlon of scaverging the oxygen free radicals，protecting the antioxygen free radical enzymes and inhibiting the lipid peroxidation in the myocaydium.
【Key words】 shenma injection;ischemia-reperfusion;NOS;GSH-Px;SOD;MAD;CK
冠状动脉缺血引起缺血性心脏病是心血管系统疾病的主要死亡原因，临床治疗主要是解除冠脉痉挛，恢复血流供应，这又使心脏经历一个缺血后恢复灌流的过程，有可能引起细胞死亡或进一步功能障碍。设法解除或减轻再灌注损伤成为此类心脏病防治研究的重点。临床研究已证实 ［1］ 参麦注射液（Shenma injection，SM）能减轻急性心肌梗死患者溶栓后再灌注损伤，本实验通过结扎/松解左冠状动脉前降支复制心肌缺血再灌注模型，以心肌组织cNOS、iNOS、GSH-Px、SOD、MAD及血清CK的水平变化反映心肌受损程度，并用SM干预，探讨SM抗心肌细胞脂质过氧化的作用机制，以此为中医药防治缺血再灌注损伤的应用，加强心肌保护提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和动物分组
1.1.1 实验仪器和试剂 ECG-6511型心电图仪（上海医疗器械厂）;TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）;结构型、诱导型一氧化氮合酶（cNOS，iN-OS）、脂质过氧化物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）双缩脲法蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所），肌酸激酶（CK）试剂盒（北京化工二厂）;参麦注射液（SM杭州正大青春宝药业有限公司）。
1.1.2 实验动物及分组采用健康成年Wistar大鼠32只，雌雄不限，体重180～240g，本院实验动物部提供。适应性喂养3天后心电图阴性者作为实验对象。动物随机分为假手术（Sham）组、缺血（MI）组、缺血再灌注（MI/R）组、参麦（SM）组，每组6只。
1.2 动物模型的制作 20%乌拉坦腹腔注射麻醉（7ml/kg），用针形电极插入四肢皮下，观察记录标准肢体Ⅱ导联心电图。气管切开，呼吸机人工呼吸，呼吸频率80次/min，开胸暴露心脏，于左心耳下缘约1mm处用6号医用缝针和0号医用缝线穿过心肌浅层作一结扎线，稳定10min左右行实验处理。各组手术步骤:Sham组:穿线不结扎，旷置2.5h;MI组:在穿线间置宽3mm橡皮条，双活结结扎左冠状动脉前降支，以心电图S-T段明显上抬，结扎线以下心肌颜色变暗为心肌缺血标志，缺血30min;MI/R组:如缺血30min方法处理，缺血30min后松开结扎线，恢复再灌注120min;SM组:在结扎左冠状动脉前降支前3天，每日腹腔注射2ml（含参麦0.4g）参麦注射液，而后处理同缺血再灌注组。以上各组动物实验完毕，摘除眼球采血备检，同时摘取心脏。
1.3 标本采集及检测方法
1.3.1 CK的检测 上述各组动物摘除眼球采血1ml后立即置入加有20μ1EDTANa 2 和10μl抑肽酶的预冷离心管内充分混匀、4℃下3500r/min，离心5min，吸取管内上清液密封后于-20℃低温冰箱保存待测。
1.3.2 cNOS、iNOS、GSH-Px、SOD、MDA的检测实验完毕，摘除部分结扎线以下左心室心肌，置于冰冷的生理盐水冲洗，除去血液，滤纸试干，分析天平称取0.2g心肌组织，放入5ml小烧杯内，用刻度吸管加入组织块重量9倍的生理盐水，制备成10%的组织匀浆，倒入离心管中，3000r/min离心15min，取上清液-20℃低温冰箱保存待测。按照试剂盒说明测定心肌组织NOS、SOD、GSH-Px的活性及MDA含量。
1.4 统计学处理 全部数据均以ˉx±s表示，组间比较用方差分析，二组间比较用q检验。
2 结果
2.1 血清CK活性及心肌组织MDA含量的变化除Sham组未检测到CK活性外，CK活性及MDA含量于MI组增加，MI/R组达高峰，SM组降低。MI/R组与各组间有高度统计学意义。4组变化见表1。
2.2 心肌组织SOD、GSH-Px活性的变化心肌组织SOD、GSH-Px活性于MI组开始降低，MI/R组降至最低，SM组SOD、GSH-Px活性增加，但低于Sham组，SM组GSH-Px活性于各组间具有统计学意义，但SOD与MI组差异无显著性。4组变化见表1。
2.3 心肌组织中cNOS、iNOS活性的变化 结果显示，MI/R组iNOS活性显著高于其他各组，cNOS活性则显著低于其他各组。SM组cNOS活性显著低于Sham组、MI组;iNOS活性显著高于Sham组（P<0.01）。4组变化见表1。
表2 心肌组织MDA含量，NOS、SOD、GSH-Px及血清CK活性的变化（略）
注:与MI/R组比较 Δ P<0.01;与Sham组、MI组比较， * P<0.01
3 讨论
细胞膜脂质微环境稳定是保证膜结构完整和膜蛋白功能正常的基本条件。心肌组织缺血再灌注后，自由基大量产生及自由基引发的脂质过氧化作用是再灌注损伤的主要原因，同时心肌缺血再灌注也改变了自由基生成和自由基消除剂之间的平衡，即心肌缺血再灌注时。自由基严重增多，自由基清除剂SOD、GSH-Px减少，而活性很强的氧自由基（OFR）与细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，其过氧化产物丙二醛（MDA）对膜有很强的破坏作用，可破坏心肌细胞膜的完整性，改变心肌超微结构，从而加剧心肌缺血，导致心肌细胞损伤［2］ 。增强心肌自由基清除系统的功能，降低缺血再灌注时自由基的产生，抑制自由基引起的脂质过氧化反应才能实现心肌细胞的保护效应。因此，具有保护SOD活性，减少MDA生成的药物都将有助于减轻心肌超微结构的损伤，应用中药防治心肌缺血损伤是近年来医学研究的热点之一。参麦注射液是传统中药人参和麦冬提取液，以往的研究表明对病毒性心肌炎、充血性心力衰竭治疗是有效的，且该药有正性肌力作用，能够增加冠脉血流量，改善心肌缺血，调整心肌代谢，降低氧耗量。
心肌酶漏出是心肌缺血再灌注损伤的主要表现。其中血清CK以灵敏度高、特异性强、发生变化时间早、持续时间长的特点而经常作为首选酶，临床上常把CK作为诊断心肌梗死和判断其梗死程度的指标之一 ［3］ 。检测MDA含量可反映机体内脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤的程度。SOD、GSH-Px对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它们是氧自由基的特异性降解酶，该酶能清除氧自由基保护细胞免受损伤，其活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力。
一氧化氮（NO）为一种细胞信使分子，由cNOS指导合成的NO在正常生理条件下，有扩张血管，抑制血小板的粘附与聚集，防止血栓形成，改善组织局部血运等保护作用;由iNOS指导生成的过量的NO产生细胞毒性作用，它可与内皮细胞、中性粒细胞生成的大量自由基迅速结合生成大量过氧亚硝基阴离子（ONOO - ），ONOO - 作为一种强大的自由基可造成细胞严重损伤。由于NO的半衰期很短，不易直接测定，常通过检测其合成限速酶一氧化氮合酶（NOS）来间接反映NO的代谢情况。NO的这种具有“保护”和“毒性”的双重作用使其成为缺血再灌注损伤中的研究热点 ［4～6］ 。本实验中，当CK、MDA由心肌缺血时即MI组开始增加，预示着心肌细胞有损伤，但程度可能较轻;再灌注2h时即MI/R组，CK、MDA进一步增加，而SOD、GSH-Px活性明显下降，提示心肌损伤加重;而SM组大鼠再灌注2h后，CK、MDA明显减少，而SOD、GSH-Px活性较高，且与MI/R组差异呈显著性，提示SM预处理在心肌缺血再灌注CK的大量释放过程中，起到了很好的抑制作用，因其释放减少反映了心肌缺血再灌注过程中心肌细胞的损害大大降低。实验结果表明，SM具有保护内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，减轻心肌细胞膜脂质过氧化的损伤，维持膜结构的完整性，抑制细胞内CK外漏，明显改善再灌注损伤心肌的预后。实验中SM组CK释放量与Sham组及MI组相比较仍有显著差异（P<0.01），可能与给药剂量有关，但仍能说明SM能抑制CK的择放，呈现对心肌细胞的良好保护作用。
生理情况下，内皮细胞持续释放NO，发挥其细胞保护作用，当心肌缺血再灌注至无复流损伤后，血管内皮细胞受损，cNOS活性降低，NO合成减少。本实验发现，MI/R组心肌组织cNOS活性降低，iNOS活性增加，提示缺血再灌注诱发一氧化氮合酶系统功能紊乱，使与cNOS活性相关合成的NO减少，而与iNOS活性相关的NO合成增加，将发挥NO的细胞毒性作用。SM组较MI/R组cNOS活性明显上调，iNOS活性下调，虽仍分别低于和高于MI组，但不排除SM具有保护血管内皮细胞并逆转一氧化氮合酶系统的功能紊乱，即与其减少再灌注期由iNOS诱导的NO生成，从而抑制ONOO-生成及细胞损伤有关。
本实验结果表明:SM具有升高再灌注心肌组织中SOD及GSH-Px活性，降低NO、MDA含量及血清CK活性，维持心肌细胞氧化和抗氧化平衡，阻断脂质过氧化的链锁反应，干预自由基的产生并增强清除自由基的功能，因此保护了心肌细胞膜的完整性，抑制细胞内CK的外漏。但由于心肌缺血再灌注损伤机制复杂，膜脂质过氧化仅是其中原因之一，而参麦注射液心肌保护的作用机制可能是多方面的，这还有待于进一步深入的研究 ［7］ 。
【参考文献】
1 宋建丽.参麦注射液治疗冠心病的临床分析.药学进展，1999，23（1）:44-45.
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3 中国医学科学院心血管病研究所基础研究室.血清肌酸激酶在急性心肌梗塞诊断中的价值.心血管疾病，1974，2:278.
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6 焦向英，罗宁，赵荣瑞.NO对心脏缺血再灌注损伤的影响及其在缺血预处理中的作用.中国病理生理杂志，2002，18（10）:1254-1257.
7 崔世涛，朱洪生.一氧化氮及其合酶在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究.中华胸心血管外科杂志，1999，15（6）:364-366.
作者单位:430064湖北武汉，湖北中医学院