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临床化疗失败的主要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生内在性和获得性多药耐药。多药耐药(multidrug resistance， MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时，对其他结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药的现象。因此，如何逆转，特别是在基因水平逆转MDR，已是肿瘤研究的热点。近年来，国内外在基因水平逆转MDR方面展开了广泛而深入地研究，现就相关策略作一综述。
1 表达调控基因的应用
1.1 细胞因子基因 Stein等研究发现一些细胞因子如TNF、IFN和IL-2可降低基因mRNA和P-gp的表达水平，增加细胞对药物的敏感性。但细胞因子静脉应用副作用极大，因此，他们将细胞因子基因转入肿瘤细胞，结果显示可明显降低MDR1mRNA和P-gp的表达水平，使细胞内药物浓度提高［1］。
1.2 癌基因和抑癌基因 研究显示，抑癌基因P53的突变可激活MDR1基因的启动子，增加MDR1基因的表达。因此，利用突变型P53基因的反义基因或向细胞内导入野生型P53基因，是MDR基因治疗的重要方向［2］。
2 反义RNA的应用
自20世纪80年代初发现反义RNA以来，其作为一种调控特定基因表达的手段，已被广泛研究。但RNA易受RNA酶（RNase）的降解，致使在实践中直接注射反义RNA受到限制，故研究者常体外构建含反义CDNA的载体，然后导入细胞中，不断转录出反义RNA，阻碍靶mRNA的翻译过程。
根据MDR的不同机制，需设计不同的反义RNA逆转MDR。Chan等［3］针对MDRL mRNA把其反义CDNA插入pcDNA3载体中，然后导入耐阿霉素的肝癌细胞株HepG2/ADM中，结果发现导入该CDNA的HepG2/ADM细胞有如下表现：（1）其MDRL mRNA水平几乎与正常HepG2一样；（2）P糖蛋白(P-gp)在导入反义CDNA 48h后开始下降；（3）对阿霉素的敏感性较未导入反义CDNA的HepG2/ADM细胞提高了83.3%，逆转效果明显。Haga等［4］用含有多药耐药相关蛋白3(MRP3)反义CDNA的载体转染内源性表达MRP3的神经胶质瘤细胞株NHG2，结果使NHG2对顺铂的敏感性提高了5倍。因此，有学者构建的表达MGMT反义RNA的逆转录病毒载体，能明显抑制肿瘤细胞的MDR。
尽管实验证明反义RNA可以明显降低MDR蛋白的表达，但其应用仍存在两大难题：（1）反义RNA易受RNase降解；（2）底物拷贝数太多，且又不断生成，难以完全控制。所以仍有待进一步研究。
3 反义寡脱氧核苷酸的应用
用反义寡脱氧核苷酸（antisense ologodeoxyribonucleotides，asON）阻止靶细胞mRNA的转录与翻译，其作用机制如下：（1）asON在一定条件下与目的基因的双螺旋DNA结合，形成局部的分子间三链，干扰核蛋白因子，聚合酶与DNA结合，因此可在转录水平抑制靶基因表达；(2)asON 也可与靶mRNA直接结合，抑制其转运到核糖体；（3）asON能与翻译的起始位点结合，阻抑翻译过程；（4）核糖核酸酶RNase H能特异性的切割RNA/DNA杂交双链中的RNA。基于脱氧核苷酸体外易于合成，也能与RNA互补配对，因此在实践中常用。
Alahari等［5］设计的转铁蛋白修饰的硫代磷酸型asON，延长了其半衰期。将其导入MDR细胞KBVMCF-7中，可特异性地与mdrl mRNA的546-565位点碱基结合，明显降低了P-gp的表达。最近，Kostenko等设计并应用了5’-2芘基1，3-氨已基寡脱氧核苷酸逆转KB细胞的MDR，结果针对mdrl mRNA第178和194位点的寡核苷酸能降低mdrl mRNA 90%。针对MRP的asON能提高神经胶质瘤细胞对阿霉素、顺铂等化疗药物的敏感性［6］。
4 核酶的应用
核酶是一类具有酶活性的RNA分子，针对有害基因或失控基因可设计出多种特异性的核酶，降解目的mRNA。其优越之处在于： (1)核酶具有较为稳定的空间结构，不易受到RNase的破坏；（2）更重要的是核酶可重复使用，在切割完一个靶RNA分子以后，又可以从杂交链上解脱下来，对新的RNA进行切割反应；（3）与反义RNA相比，具有封闭和切割双重作用。目前，核酶逆转MDR大多数是针对mdrl mRNA，通过对mdrl mRNA的特定位点进行切割来阻断P-gp的表达，达到逆转MDR的目的。
Wang等［7］在mdrl mRNA全长序列中找到260个可供酶切识别的位点（GUC），进而又优选出了3个GUC位点，根据这3个位点设计了相应的锤头状结构的核酶，并将不同的核酶转染到耐药的白血病细胞株MOLT-3/TMQ800中，结果显示，针对第179和196密码子处GUG设计的核酶，明显降低了该耐药的细胞中的MDRL mRNA水平并减少了P-gp的表达量，使该耐药细胞重新获得对化疗药物的敏感性。徐东平等［8］构建了含有MDRL核酶的腺病毒载体，将其导入淋巴瘤细胞株和淋巴瘤动物体内可逆转MDR，使细胞恢复对长春新碱的敏感性。针对非耐药相关蛋白（lung resistance related protein，LRP）而设计的特异性核酶，也可以使LRP的MDR癌细胞得到一定程度的逆转［9，10］。而在保持核酶特异性的同时，如何提高核酶的产量和活性是目前研究的重点。
5 RNA干扰
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它将与目的基因同源的含21～23个核苷酸的小分子干扰RNA片断（small interfering RNAs，siRNA）转染至靶细胞，与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex， RISC），RISC以siRNA为模板特异性地识别其同源基因mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的mRNA降解，从而抑制基因表达。与以上几种基因技术相比，RNAi具有高效性和高度特异性等特点，是一种全新的基因手段。
2001年Elbashir等［11］首次报道siRNAs在哺乳动物体外培养细胞内成功诱导基因特异阻抑以后，siRNA是否可应用于人类疾病的治疗受到了广泛的关注。彭智等［12］设计了以mdrl基因为靶标的siRNA，观察其对多药耐药细胞株K562/A02 mdrl基因和p-糖蛋白(P-gp)表达及功能的影响。结果显示，siRNA序列能有效地封闭mdrl基因，使MDRL mRNA相对水平下降(58.0±1.54)%;P-gp表达由处理前的(76.0±1.0)%降到处理后的(19.6±1.9)%；对阿霉素药物敏感性的相对逆转效率为70.4%；同时使K562/A02细胞内柔红霉素积累量增加。提示siRNA可望成为逆转多药耐药新的有效手段。
6 问题与展望
基因水平逆转MDR必将从实验走向临床，但要作为治疗肿瘤常规的方法，尚有以下问题有待解决：（1）MDR是一个非常复杂的生物学过程，是肿瘤细胞对适者生存规律的具体表现，一种肿瘤药物耐药可能涉及多种耐药基因，蛋白表达的改变；而一种肿瘤细胞的耐药性也可能涉及几种耐药机制的参与，若针对某一因素进行逆转，常不能完全逆转MDR。（2）在体内的特异性和靶向性是全部基因治疗的关键，理想的治疗应是针对靶细胞而不是影响其他组织细胞。因此，对MDR进行基因水平逆转时应从MDR的不同参与机制着手，研制和开发高效、特异、低毒的载体系统，寻求耐药相关的靶基因、靶蛋白，多层面、多靶点同时或有序地抑制多种相关MDR基因的表达，减少盲目性，提高预见性，为肿瘤化疗开创新的前景，提高肿瘤患者的生存期和存活率。
【参考文献】
1 孙等军.肿瘤多药耐药治疗措施研究进展.国外医学·肿瘤学分册，2002，29（4）：274-277.
2 Kigawa J，Sato S，Shimada M，et，al.P53 gene status and chemosensitivity in orarian cancer.Hum Cell，2001，14(3)：165-171.
3 Chan JY，Chu AC，Fung KP.Inhibition of P-glycoprotein expression and reversal of drug resistance of human hepatoma Hep G2 cells by multidrug resistance gene mdrl antisense RNA.Life，2000，67：2117-2124.
4 Haga S，Hinoshita E，Ikezaki K，et al.Inrovement of the multidrug resistance protein 3 in drug sensitivity and its expression in human glioma.Jpn J Cancer Res，2001，92：211-219.
5 Alahari SK，Delong R，Fisher MH，et al.Novel chemically modified oligonucleotides provide protent inhibition of P-glycoprotein expression.J Pharmacol Exp Thar，1998，286：419-428.
6 Mohri M，Nitta H，Yamashita J.Expression of multidrug resistance-associated protein(MRP) in human gliomas.Neyrooncol，2000，49：105-115.
7 Wang FS，Kobayashi H，Liang KW，et al.Retrovirus-mediated transfer of anti-MDR1 ribozynes fully restores chemosensitivity of P-glycoproprotein expressing human lymphoma cells.Hum Gene Ther，1999，10：1185-1195.
8 徐东平，王福生，Takao O，等.腺病毒介导的抗MDR1核酶基因转移联合化疗药物治疗恶性淋巴瘤的研究.中华肿瘤杂志，2002，24：529-532.
9 Akiyama S，Chen ZS，Kitazono M，et al，Mechanisms for resistance to anticancer agents and the reversal of the resistance.Hum Cells，1999，12：95-102.
10 Kitazono M，Sumizawa T，Take bayashi Y，et al.Multidrug resistance and the lung resistance-related protein in human colon carcinoma SW-620 cells.J Natl Cancer Inst，1999，91：1647-1653.
11 Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature，2001，411：494-498.
12 彭智，肖志坚，王一，等.SiRNA逆转K562/A02细胞多药耐药的研究.中华血液学杂志，2004，25：5-7.
(编辑：罗 彬)
作者单位： 650118 云南昆明，云南省肿瘤医院内一科