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【摘要】 目的 研究三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）对局灶性脑缺血再灌注后星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。方法 采用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞脑缺血再灌注模型。实验动物随机分为假手术组、模型组、三七总皂苷组和尼莫地平对照组。缺血2h再灌注46h后，采用免疫组织化学法检测脑组织内GFAP蛋白的表达。结果 缺血再灌注后可诱导脑组织GFAP表达增强，三七总皂苷、尼莫地平均可抑制缺血再灌注后海马CA1区GFAP的表达（P＜0.05和P＜0.01），尼莫地平还可抑制皮质区GFAP的表达（P＜0.01）。结论 局灶性脑缺血再灌注后，可诱导脑组织GFAP表达增强，三七总皂苷可抑制脑缺血后星形胶质细胞GFAP的高表达，提示PNS可能对缺血诱导的胶质细胞活化具有抑制作用，这可能是PNS抗脑缺血损伤作用的机制之一。
【关键词】 脑缺血再灌注；大鼠；三七总皂苷；胶质纤维酸性蛋白
脑缺血后再灌注可导致严重的迟发性神经元损伤，影响患者的预后和功能恢复。寻找有效的防治脑缺血再灌注损伤药物已成为国内外的研究热点。星形胶质细胞在脑内执行着与调节微环境和神经传递有关的重要功能，并且为神经元提供营养物质和神经营养因子，对神经元生成、发育、再生和分化均有重要作用。另一方面，星形胶质细胞通过扩展性抑制作用而加重脑损伤。本实验采用阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血模型，研究三七总皂苷对脑缺血后星形胶质细胞内GFAP表达的影响，以揭示PNS抗脑缺血作用与星形胶质细胞的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组 SD大鼠，雌雄各半，体重280～300g，由湖南农业大学实验动物中心提供。随机分为4组，即假手术组、模型组、PNS组，尼莫地平对照组。
1.2 实验动物模型 参照Longa等［1］的线栓改良法复制大鼠左侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）局灶性脑缺血模型，大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg，ip）麻醉后，将一长5cm，直径0.26mm尼龙线（多聚赖氨酸处理，用前浸泡肝素）经左侧颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18～20mm感到轻微阻力时，即阻断大脑中动脉。阻断2ｈ后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端，缝合皮下组织和皮肤，完成缺血再灌注损伤模型。假手术组除不插线外，全过程同模型组。按照Longa的5分法评分［2］：0分无神经缺损症状；1分右前肢不能完全伸直；2分向右旋转；3分向右侧倾倒；4分不能向右行走或昏迷。1～4分为有效模型。 各组大鼠均在再灌注46h后取材。麻醉后开胸，右心房剪一小口，由左心室插入灌注针头，灌入生理盐水150ml，直至右心房流出清亮液体，再灌入4%多聚甲醛100ml 进行灌注固定。
1.3 给药方法 三七总皂苷，丽珠集团利民制药厂，批号：ZZ-5802，粤卫药准字（1994）第801313号，商品名：血栓通注射液，规格：2ml（70mg）/支。尼莫地平注射液，浙江一新制药股份有限公司，批号01092001，规格20mg/ml。用药剂量：PNS25mg/kg，尼莫地平1mg/kg。于缺血前5min第一次给药，腹腔注射（ip），以后每隔12h给药1次，共给药4次；假手术组和模型组给予等体积生理盐水。
1.4 免疫组织化学测定胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein ，GFAP） 脑组织用4%多聚甲醛固定4h后，行冰冻切片，冠状切取视交叉后1～4mm脑组织，厚度为20μm。采用漂片法染色，观察DAB显色情况。
1.5 指标观察及统计学处理 高倍镜下以测微尺计数单位面积（125×125μm2）内GFAP阳性细胞数，每个标本取5个视野，取其平均值。用SPSS11.0统计软件进行完全随机资料的方差分析，组间均数比较用q检验，实验结果以±s表示，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 病理形态学观察 假手术组HE染色未见明显神经元病理性损伤。缺血再灌模注型组可见梗死灶主要位于大鼠左侧大脑皮质及基底节区，缺血侧大脑半球着色明显变淡，呈典型的缺血性改变，神经元胞体缩小，尼氏体消失，可见核溶解、核碎裂、核固缩，核仁消失，病变部位与周围组织界线较清楚，其中心区神经元数量明显减少。而三七总皂苷、尼莫地平治疗组梗死中心区范围减小，病理改变较再灌注组轻，仅少数锥体细胞胞浆深染，细胞核固缩。
2.2 PNS对GFAP表达的影响 缺血2h再灌注46h后，免疫组织化学法测定GFAP，假手术组脑皮质GFAP无明显表达，脑白质如胼胝体可见GFAP阳性星形胶质细胞，但GFAP阳性反应弱，突起细，胞体较小，其余部位GFAP阳性细胞少见。模型组在上述区域及左侧海马区和皮质区（主要是在皮质表层），均可见大量GFAP阳性细胞，树突增粗，胞体肿胀，即反应性星形胶质细胞。对侧脑与假手术组无明显差异。同模型组相比较，三七总皂苷、尼莫地平治疗组GFAP表达数量明显减少，胞体肿胀减轻。我们主要比较了海马CA1区和皮质区表层的GFAP表达情况：海马CA1区GFAP比较，三七总皂苷、尼莫地平组GFAP表达均显著低于模型组（P＜0.01和P＜0.05）。皮质区GFAP比较，尼莫地平组GFAP表达显著低于模型组（P＜0.01），三七总皂苷组与模型组比较，差异无显著性（P＞0.05），见表1。
表1 各组脑组织GFAP表达比较（略）注：与假手术组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
3 讨论
实验结果显示，假手术组GFAP在星形胶质细胞中表达不明显，且树突较细，主要分布在白质区。脑缺血后，在缺血中心区GFAP染色减弱或消失，但在周边区如海马可见大量GFAP阳性细胞，树突增粗，胞体肿胀，远离缺血区的皮质表层胶质细胞也有广泛表达；这种反应性胶质细胞增生在一定程度上反映了脑缺血缺氧的程度。三七总皂苷可明显抑制海马CA1区星形胶质细胞GFAP的表达，同时又能显著减轻神经元的损害，表明PNS可能通过减轻缺血性脑损伤，从而减轻了胶质细胞的活化程度。
【参考文献】
1 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats．Stroke，1989，20：84-91.
2 Palacios G，Mengod G，Tortosa A，et al. Increased beta-amyloid precursor protein expression in astrocyte in the gerbil hippocampus following ischemia association with proliferation of astrocytes . Eur J Neurisic，1995，7(3):501-510.
(编辑：邓 锋)
作者单位： 410007 湖南长沙，湖南中医学院生理教研室