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【摘要】 本课题用人血管生成基因芯片对双灵固本散处理前后人胃癌细胞BGC-823细胞血管生成相关基因的表达水平变化进行定量研究。在检测到的8个表达有明显改变的血管生成相关基因中，7个明显升高，1个明显降低。几个血管生成抑制基因表达的显著升高，说明该药物可能对肿瘤产生抑制并促进肿瘤细胞分化，但其对肿瘤组织的血管生成的具体影响， 还有待进一步的活体实验来证明。
【关键词】 灵芝(Ganoderma lucidum Karst)；双灵固本散；血管生成；胃癌
The regulation of sunrecome(Shuanglinggubensan) on the expression of angiogenesis related genes in human gastric tumor cell
WANG Tao,WU Hou,TANG Li,et al.
School of Life Sciences of Shanghai University, Shanghai 200436,China
【Abstract】 In this research work, the change of the expression of the angiogenesis related genes in cultured gastric tumor cell BGC-823 after treatment with a commercial traditional Chinese medicine product -Sunrecome(Shuanglinggubensan) was measured, by using angiogenesis related gene array (purchased from Superarray). And the drug treatment up-regulated the expression of 7 angiogenesis related genes markedly, while the expression of 1 angiogenesis related gene was down-regulated.The Sunrecome(Shuanglinggubensan) can prevent the angiogenesis of gastric tumor, but it should be proved by research in vivo.
【Key words】 ganoderma lucidum Karst;sunrecome(Shuanglinggubensan);angiogenesis;gastric tumor
灵芝（Ganoderma lucidum Karst）是一种传统的中药，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属。灵芝首载于《神农本草经》，历代医家都认为其能够治疗多种疾病。
现代药理研究表明，灵芝具有很强的抗癌作用。已证明灵芝具有抑制肿瘤组织血管生成［1］，抑制肿瘤转移［2，3］，诱导人乳腺癌细胞［4］、前列腺癌细胞［5］、结肠癌细胞［6］等凋亡的作用。但迄今为止，大多数的研究还停留在对灵芝及其有效成分的生理作用研究，及对某些代谢途径的少数几种酶活性或其基因表达水平作用的研究上。本文采用基因芯片法，对双灵固本散处理后的人胃癌细胞BGC-823进行细胞血管生成相关基因表达研究，以期为双灵固本散良好的疗效提供进一步的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
双灵固本散由上海绿谷（集团）公司生物医药研究所提供；人胃腺瘤细胞BGC-823购于中科院细胞所；人血管生成基因芯片(GEArray Q Series Human Angiogenesis Gene Array)购于美国Superarray公司。
CO2培养箱，Thermo Forma公司；倒置显微镜，Nikon公司； Gene Quant核酸定量仪, Pharmacia Biocech 公司；Heraeus高速冷冻离心机， Biofuge公司；Mill-Q超纯水净化仪，Millipore公司； 1640完全培养液，Bibgo公司；Trizol试剂，上海生工生物工程技术有限公司提供，其余药品均为进口试剂。所有实验用品均经灭菌处理。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将对数生长的胃癌细胞BGC-823置于37℃，100%相对湿度，含5%二氧化碳、95%空气的培养箱内，在含15%小牛血清的RPMI 1640培养液中贴壁生长，以EDTA-胰酶混合溶液消化传代。
1.2.2 细胞的药物处理 以20ml（1.0×105/ml）剂量浓度接种在50ml培养瓶中，孵育24h后，倾去培养液，将加药培养液（5mg/ml）加入3个生长BGC-823的培养瓶中，每瓶20ml，对照组每瓶加20ml不加药物的1640培养液，孵育24h后，倾去培养液，每瓶加5ml胰酶溶液消化，待细胞脱壁后，将消化液转移至15ml离心管中，50g离心5min，倒出上清液，细胞沉淀于离心管中液氮冷冻，然后转移到-70℃保存。
1.2.3 细胞总RNA的提取 将处理后的细胞样品和对照细胞样品（每管约1×107个细胞）分别用1ml的Trizol试剂重悬，用匀浆器将细胞匀浆，然后按生工提供的方法提取总RNA，将70％乙醇洗过的RNA溶解于DEPC处理过的水中，并用GeneQuant定量。
1.2.4 cDNA探针的标记 按Superarray公司提供的方法标记对照和处理样品的cDNA。总RNA的用量为15～20μg。
1.2.5 芯片的杂交及检测 按GEArray Q Series Human Angiogenesis Gene Array试剂盒及其化学发光检测试剂盒的方法进行，稍有改动。
1.2.6 芯片检测结果的分析 用ScanAlyser和GEArray Analyzer软件分析杂交的结果。每个基因的表达量用每个杂交点的信号强度除以看家基因GAPD的强度表示。基因的表达水平变化=药物处理细胞中基因表达水平/未经药物处理细胞中基因表达水平。变化超过3倍即认为变化显著。
2 结果与讨论
用GEArray Q系列人细胞血管生成检测芯片，对双灵固本散处理过和未经药物处理的胃癌细胞BGC-823中与细胞血管生成有关的96个基因的表达水平进行了杂交检测。并观察到双灵固本散对一些血管生成相关基因表达的促进作用(图1)。在8个表达显著变化的基因（表达量>1.0E-1）中，7个表达明显升高，1个表达降低（表1）。
Fig.1 A.The hybridization of the biotin-labeled cDNA from the drug treated gastric tumor cell BGC-823 to the GEArray Q seris Human Angiogenesis Gene Array (Catalog No. HS-009N purchased from Superarray).（略）
B. The hybridization of the biotin-labeled cDNA from non-drug-treated BGC-823 to the same array as in A.（略）
Table 1 The quantitation of the Fig 1 hybridization (human angiogenesis) by ScanAlyze and GEArray Analyzer（略）
血管生成过程是由已存在的血管长出新血管的过程，此过程包括了细胞间质的分解，内皮细胞的增生、迁移及分化，最后长出新的血管。而肿瘤的生长需要血管生成的参与，因此调控血管生成作用的因子可以影响肿瘤的生长［7］。临床与动物实验都证明，如果没有新生的血管供应营养，肿瘤在达到1～2mm的直径或厚度后，即107个细胞左右将不再增大。因此诱导血管生成是恶性肿瘤能生长、浸润与转移的前提之一［8］。
Vasostatin是1998年Pike等［9］从经EB病毒转化的B细胞系-VDS-O的培养上清液中提纯出的一种血管生成抑制因子，经鉴定为人体一种多功能蛋白质calreculin的N端结构域片断。将Vasostatin以MBP融合蛋白形式在大肠杆菌中表达并进行纯化，经体外活性实验证实对内皮细胞HUVEC和FBHE的增值有剂量依赖性的抑制作用；在小鼠Matrgel实验中，Vasostatin浓度为5～10mg/L时可抑制碱性成纤维细胞生长因子诱导的新生血管化；在无胸腺小鼠肿瘤形成实验中，Vasostatin可明显减低人Burkitt淋巴瘤和人结肠癌的生长［9～11］。
Ephrin B4是Eph家族一员。Eph家族是最大的酪氨酸蛋白激酶受体家族，已有14个成员，在神经轴突导向、血管发生及肿瘤形成方面具有重要的作用［12,13］。其能通过对磷脂酰肌醇激酶3（phoshatidylinositol 3-kinase，PI3）的活化，激活腺苷酸环化酶，从而使细胞内cAMP增加。后者能启动cAMP依赖性蛋白激酶A，此酶能延缓肿瘤细胞的增殖周期。PI3活化后也能抑制MMP基因的表达，从而使肿瘤细胞的侵袭和迁移受阻［14,15］。
尽管本实验中血管内皮生长因子（VEGF）表达也有明显升高，但在成人体内， VEGF的高表达并不诱导新生血管的形成［16］，即相对血管生成因子，血管抑制因子在体内更占优势。且研究表明VEGF水平差异并不能说明细胞系的癌化能力［17］。几种血管生成抑制因子表达的升高，表明双灵固本散对胃癌细胞血管生成有一定抑制作用，尽管如此，双灵固本散对肿瘤组织的血管生成的具体影响，仍有待进一步的活体实验来证明。
【参考文献】
1 Kimura Y, Taniguchi M, Baba K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: mechanism of action and isolation of an active substance. Anticancer Res，2002，22(6A):3309-3318.
2 Sliva D, Labarrere C, Slivova V,et al. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun，2002，298(4):603-612.
3 Liu X, Yuan JP, Chung CK,et al. Antitumor activity of the sporoderm-broken germinating spores of Ganoderma lucidum. Cancer Lett，2002，182(2):155-161.
4 Hu H, Ahn NS, Yang X,et al. Ganoderma lucidum extract induces cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cell. Int J Cancer，2002，102(3):250-253.
5 Sliva D, Sedlak M, Slivova V,et al. Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for the inhibition of highly invasive human Breast and prostate cancer cells. J Altern Complement Med,2003,9(4):491-497.
6 You YH, Lin ZB. Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species. Acta Pharmacol Sin，2002，23(9):787-791.
7 Robert S. Kerbel Tumor. Angiogenesis: past, present and the near future. Carcinogenesis,2000,21(3)：505-515.
8 Reed JC, Warner Lamber, Parke-Davis.Award lecture: mechanism of apoptosis. American Journal of Pathology，2000，157(5):1415-1430.
9 Pike SE, Yao L, Jones KD, et al. Vasostatin, a calreticulin fragment, inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth. J. Exp. Med, 1998, 188(12): 2349-2356.
10 Yao L, Pike SE, Setsuda J, et al. Effective targeting of tumor vasculature by the angiogenesis inhibitors vasostatin and interleukin-12. Blood, 2000,96(5):1900-1905.
11 Pike SE, Yao L, Setsuda J, et al. Calreticulin and calreticulin fragments endothelial cell inhibitors that suppress tumor growth. Blood, 1999, 94(7): 2461-2468.
12 Wang HU, Chen ZF, Anderson DJ. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by Eephrin B2 and its receptor Eph B4. Cell, 1998，93(5):741-745.
13 Yuan K, Jin YT, Lin MT. Expression of Tie-2, angiopoietin-1, angiopoietin-2, ephrinB2 and EphB4 in pyogenic granuloma of human gingiva implicates their roles in inflammatory angiogenesis. J Periodontal Res, 2000，35(3):165-171..
14 Liceiri BP, Cheresh DA. The role of alphav integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development. J Clin Invest,1999，103(9):1227-1230.
15 Steinle JJ, Meininger CJ, Forough R,et al. Eph B4 receptor signaling mediates endothelial cell migration and proliferation via the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. J Biol Chem，2002，277(46):43830-43835.
16 Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor.J Mol Med, 1999，77(7):527-543.
17 Watnick RS. Ras modulates Myc activity to repress thrombospondin-1 expression and increase tumor angiogenesis. Cancer Cell , 2003, 3, 219-231.
(编辑：汪 洋)
作者单位： 200436 上海，上海大学生命科学学院