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【摘要】 目的 研究注射用胶原酶对三种亚型胶原蛋白的水解率。方法 通过绘制注射用胶原酶对三种亚型胶原蛋白的水解作用随时间的变化趋势图，来判定注射用胶原酶对何种亚型的胶原蛋白水解率最高。结果 注射用胶原酶对三种亚型胶原蛋白的水解率不同，以对Ⅲ型胶原蛋白的水解作用最强。结论 纤维环外层以Ⅰ型胶原为主，由外向内Ⅰ型胶原逐渐减少。突出椎间盘Ⅰ型胶原含量增加，纤维环Ⅰ型／Ⅱ型的比例升高。由于注射用胶原酶对三种亚型的胶原蛋白水解率是Ⅲ型＞Ⅱ型＞Ⅰ型，所以，胶原酶化学溶解术治疗腰椎间盘突出症的疗效具有逐步显现、缓慢增加、渐趋稳定的特点。
【关键词】 胶原酶；胶原蛋白；水解；率
The research of collagenase injection hydrolytic rate to different subtype collagen
JIN Xing，ZHANG Hong-mei，YANG Chun-sheng，et al.Shenyang Orthopaedic Hospital，Shenyang 110044，China
【Abstract】 Objective To research collagenase solution hydrolytic rate to three different types collagen. Methods Through drawing time-changing trend diagram of collagenase solution hydrolysis to three types collagen，to judge which one type collagen hydrolytic rate is the highest by collagenase solution.Results Collagenase solution have different hydrolytic rate to three types collagen and the hydrolysis to type Ⅲ collagen is the strongest. Conclusion Outer layer of fibering is predominant with type Ⅰcollagen，and gradually decrease from outer layer to inner layer. （The content of typeⅠcollagen in prolapse intervertebral disc increased.） The ratio of typeⅠ to typeⅡ rises.As collagenase solution hydrolytic rate to three types collagen is typeⅢ >typeⅡ> typeⅠ，the treatment effect of collagenase chemolysis to lumbar intervertebral disc，and the prolapse is characterized by appearing gradually，increasing slowly and stablizing little by little.
【Key words】 collagenase；collagen；hydrolytic； rate
腰椎间盘突出症在临床上较为常见。近来研究表明，导致腰椎间盘突出症生化因素可能有以下两点［1］：一是突出的椎间盘中胶原蛋白的质和量的变化，影响了椎间盘结构的强度和功能稳定；二是突出椎间盘组织中的胶原酶活性高于正常椎间盘组织中的胶原酶活性，致使椎间盘中的胶原纤维被水解。注射用胶原酶的化学名为：胶原蛋白水解酶（Collagenase）［EC 3.4.24.3］，简称胶原酶。由于它在人体生理pH及正常体温下，能对椎间盘组织的主要生化组分胶原蛋白进行特异性水解，使椎间盘突出物缩小或消失，进而解除其对神经根的压迫，而不损伤其他蛋白质和组织，达到治疗或治愈的目的。所以，Sussman［2］于1969年提出使用胶原酶化学溶解术来治疗腰椎间盘突出症。目前国内临床所使用的注射用胶原酶制剂，是由溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum）发酵，经提取、精制、加入适量的赋形剂和稳定剂制成。由于人体内源性胶原酶与注射用胶原酶制剂，在对胶原蛋白的水解方式和水解速率上有很大的不同［3］，因此，本研究旨在探讨注射用胶原酶制剂在体外对腰椎间盘的主要结构蛋白——Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白水解率的差异。
1 材料与方法
1.1 试剂 注射用胶原酶1200u/支（上海味邦乔源生物制药有限公司，批号20030301）；胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（Sigma）；Tris（BBI）；其余均为国产分析纯试剂。
1.2 仪器 MD100-1型电子天平（上海天平仪器厂）；PHSJ-3F型酸度计（上海雷磁分析仪器厂）；电热恒温水浴箱（江苏金坛仪器厂）；UV-9100紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；微量酸碱滴定管。
1.3 方法 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白分别用0.2mol/L 的乙酸溶液配制成质量浓度为0.25%的溶液。37℃振荡48h以促进胶原蛋白的溶解，临用前将3种蛋白溶液调节至pH7.5。注射用胶原酶用生理盐水溶解稀释至6.0u/ml，用前配制。除供试酶液外，按表1配制各反应体系，混匀后37℃预热5min。样品组、酶对照分别加1ml供试酶液，并混匀置37℃水浴进行反应。间隔10min取各反应体系的反应液0.25 ml，加90μl无水乙醇终止反应，编号后置于-20℃冰箱中保存待测。所设定的反应时间为0～100min。上述各终止反应样液加蒸馏水1ml，混匀后12000转/min离心15min，取上清液1ml至对应编号的试管中。各试管依次加1ml柠檬酸缓冲液（0.1mol/L柠檬酸钠，pH5.0）和1ml氰化钾-茚三酮溶液（A液：氰化钾65mg加入100ml蒸馏水；B液：茚三酮0.625g加入乙二醇甲醚12.5ml；C液：1.25ml A液加入B液中，用乙二醇甲醚稀释至溶液由缨红色变为黄色即可，总体积约30ml）。混匀后沸水浴15min，置冷水浴10min。最后各试管加入60％（体积比）的乙醇溶液3ml，在波长570nm处测定其光密度值。以酶促各反应体系反应液的A570值减去相应间隔时间的酶对照液的和底物对照液的A570值，即为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白在本实验条件下被胶原酶水解的指标，见表2、图1。 表1 注射用胶原酶水解三种亚型胶原蛋白的酶促反应体系表2 注射用胶原酶水解三种亚型胶原蛋白不同时间段的A570值 图1 注射用胶原酶水解三种亚型胶原蛋白的速率曲线
2 结果
从图1可见，Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白在100min内已经完全水解，A570吸收值趋于平缓，而Ⅰ型胶原蛋白的A570吸收值仍趋于上升的势态。因此，在本实验条件下，注射用胶原酶对三种亚型胶原蛋白的水解率是Ⅲ型＞Ⅱ型＞Ⅰ型。
3 讨论
胶原酶是指只作用于胶原或其变性明胶、而不水解其他蛋白的酶类，多种微生物、动物的许多组织均可产生胶原酶［3］。其中对溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridiumhistolyticum）来源的胶原酶研究较为详尽。不仅早已产业化，而且其来源的胶原酶也已作为工具酶和药品，在临床用于治疗腰椎间盘突出症、前列腺肥大和预防及治疗瘢痕增生、烧伤脱痂、Dupuytren病以及青光眼等。
腰椎间盘突出症的原因之一，是突出的椎间盘中胶原蛋白的质和量的变化影响椎间盘结构强度和功能稳定。正常人椎间盘含有Ⅰ型和Ⅱ型胶原以及其他一些微量的亚型胶原。其分布的明显特征是［4］：纤维环外层以Ⅰ型胶原为主，由外向内Ⅰ型逐渐减少，而Ⅱ型逐渐增多。靠近髓核以Ⅱ型为主，髓核中心为Ⅱ型胶原，没有Ⅰ型胶原。突出椎间盘Ⅰ型胶原含量增加，纤维环Ⅰ型／Ⅱ型的比例升高，突出髓核中Ⅱ型的含量无明显变化，但有Ⅰ型胶原出现。胶原酶因其能对椎间盘突出物的主要成分胶原蛋白进行特异性溶解（水解、降解），使椎间盘突出物缩小或消失，进而解除其对神经根的压迫，达到治疗或治愈的目的。所以，在正确地选择适应证以及合理的用药剂量范围内，如果胶原酶水解Ⅰ型胶原的效率越高于Ⅱ型和Ⅲ型，则对其治疗指数越有益。由图1结果可知，在本实验条件下，注射用胶原酶对三种类型的胶原蛋白水解率是Ⅲ型＞Ⅱ型＞Ⅰ型。正是由于注射用胶原酶对不同亚型胶原蛋白水解率的差异，从一个侧面揭示了胶原酶化学溶解术治疗腰椎间盘突出症的疗效呈逐步显现、缓慢增加、渐趋稳定的特点。同时，也从另一个方面提示，如果操作中不能做到“针抵患处、酶达底物”［5］，那么注射用胶原酶对不同亚型胶原蛋白水解率的差异是会影响疗效的。
本实验所测得的胶原酶对不同亚型胶原蛋白的水解率是在体外条件下、用单一的胶原蛋白作为底物分别测定的。而体内椎间盘突出的内环境以及胶原的结构和组成，要比试剂型胶原蛋白更为复杂。因此，注射用胶原酶对椎间盘内各亚型胶原蛋白的水解方式以及作用位点等问题还有待进一步研究。
【参考文献】
1 Robert Gunzburg，Marek Szpalski. 季爱玉主译. 腰椎间盘突出.北京:人民卫生出版社，2004，3-17.
2 Sussman B，Bromley J. Injection of Collagenase in the tyeatment of herniation lumbardisc. JAMA，1981，245:730.
3 金敏，李君文，王忠彦.微生物胶原酶研究进展.氨基酸和生物资源，2003，25（1）:3-7.
4 李书忠，胡有谷，陈培勋.椎间盘胶原分布的研究.中华骨科杂志，1992，12（3）:213-217.
5 金星.走出误区规范操作促进我国化学溶解术技术的健康发展.中国疼痛医学杂志，2004，10（1）:64.
作者单位： 1 110044 辽宁沈阳，沈阳市骨科医院
2 110016 辽宁沈阳，沈阳药科大学制药工程学院
（编辑：黄 杰）