短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白的急性毒性实验

     短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白的急性毒性实验 (pdf)

    【摘要】  目的  观察短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白对小鼠的毒性并测定半数致死量（LD50）。方法  用Bliss方法计算静脉注射和腹腔注射两种给药途径的LD50及95%的可信限。结果  静脉注射的LD50=26.869mg/ kg， 95%平均可信限23.348～30.65mg/kg，腹腔注射的LD50=39.897mg/kg，95%平均可信限35.948～44.128mg/ kg。结论  从短尾蝮蛇毒分离的磷脂结合抗凝蛋白毒性低。

    【关键词】  蛇毒；急性毒性；半数致死量

    Acute toxicity tests of phospholipids-binding anticoagulation protein from agkistrodon halys brevicaudus venom

    JIANG Ying，LI  Zhao-yan,CHEN Yuan-zhi.Department of Pharmacology ,College of Pharmacy of Guangxi Medical University ,530021 China

    【Abstract】  Objective  To observe the acute toxicity and measure LD50 of phospholipids-binding anticoagulation protein(PBAP) in mice.Methods  With Bliss method calculate the LD50 and its 95%average  average confident limit with probability by ip and iv .Results   LD50,iv=26.869mg/kg and its 95% average confident limit was 23.348～30.65mg/kg ,LD50,ip=39.897mg/kg and its 95% average confident limit was 35.948～44128mg/ kg. Conclusion  The toxicity of PBAP from agkistrodon halys brevicaudus venom is low .

    【Key words】  snake venom；acute toxicity；median lethal dose

    近年来，国内外的学者们对蝮蛇毒进行大量的研究，了解到蝮蛇毒中主要含有精氨酸酯酶、类凝血酶、激肽释放酶、纤溶酶、磷脂酶A2，并以富含精氨酸酯酶为特征，而类凝血酶、激肽释放酶、纤溶酶一般都具有精氨酸酯酶活性。我国在20世纪70年代后期开始研制蛇毒酶制剂，主要作为抗凝剂治疗血栓性疾病。分别有以下几种：东北白眉蝮蛇毒为原料制成的“蝮蛇清栓酶”；以江浙蝮蛇毒为原料制成的“蝮蛇抗栓酶”和以尖吻蝮蛇毒为原料制成的“蕲蛇毒去纤酶”。这几种酶制剂，虽然商品名称不同但均为非纯化成分，主要有效成分均为精氨酸酯酶,纯度不高［1］。本实验对短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白的急性毒性进行研究，为开发更纯、更有效的蛇毒抗凝药品做前期工作。

    1  材料与方法

    1.1  材料  短尾蝮蛇蛇毒冻干粉：由广西医科大学蛇毒研究所提供。昆明小鼠，体重20±2g，雄雌各半，由广西医科大学实验动物中心提供。 CM-Sephadex C-25、DEAE-Sepharose CL-6B、Sephacryl S-200、Sephadex G-75均为瑞典Pharmacia Biotech公司产品，其他试剂为国产分析纯。

    1.2  方法

    1.2.1  短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的分离纯化［2］  取1g短尾蝮蛇蛇毒冻干粉溶解于 0.05mol/L NaAc pH 5.8缓冲液10ml中，分别经过CM-Sephadex C-25阳离子柱、DEAE-Sepharose CL-6B阴离子柱、Sephacryl S-200和 Sephadex G-75,得到电泳纯的短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白。该蛋白是二聚体，相对分子量是24.0×103 （非还原）；等电点是pH5.2。

    1.2.2  急性毒性实验

    1.2.2.1  预实验  将健康昆明小鼠随机分成3组,每组6只,雄雌各半,用生理盐水稀释成3个不同浓度的受试药液,注射体积按10ml/kg。连续观察7天,反复实验直到找出1组动物全部死亡及1组动物全部成活的剂量为止。根据预实验结果求出正式实验的剂量比 r =（N-1）   Dn/Dm式中: r=相邻两组剂量的比值;Dm=100%死亡的剂量;Dn=0%死亡的剂量;N=正式实验所需组数。

    1.2.2.2  正式实验  通过预实验，根据上面的公式确定不同浓度用药组。随机分组，每组10只小鼠,禁食12h,不禁水，分别进行腹腔注射和尾静脉注射,在24h内做多次观察，以后每天观察1次以上，连续观察7天,记录动物毒性反应情况和死亡动物分布，并及时对死亡的动物进行尸检，记录病变情况。另设10只作为生理盐水对照组。用Bliss法计算小鼠的LD50和95%的可信限。

    2  结果

    2.1  中毒症状  静脉注射与腹腔注射两种给药方式小鼠症状相似，大剂量组注射药物后约5min即出现呼吸加快、毛蓬松、蜷缩、抖动、厌食、嗜睡等现象，约2h内有多数动物陆续死亡。除最小剂量外，其他剂量组在7天内有数量不等的动物死亡。死亡的动物解剖肉眼未见心、肝、肺、肾、脾等重要器官出血、坏死等异常表现。存活动物在给药24h后精神、活动、食欲均恢复正常。

    2.2  计算LD50  通过预实验和正式实验,小鼠腹腔和静脉2种方式给药的半致死量(LD50)见表1、表2，其中LD50取值按95%的可信限为标准。表1  用 Bliss法计算腹腔注射半数致死量（略）表2  用 Bliss法计算静脉注射半数致死量（略）

    3  讨论

    黎渊弘等人［2］已经成功地从短尾蝮蛇中分离纯化磷脂结合抗凝蛋白，并且对其进行了生化性质的研究，还证明了它具有明显的抗凝活性。 而此抗凝蛋白没有类凝血酶、激肽释放酶和纤维蛋白（原）溶解酶这3酶的活性，是一种具有精氨酸酯酶活性的新型抗凝蛋白。并对其药效也进行了一定程度的研究，对家兔脑血栓模型也有比较好的效果。

    而本实验主要观察短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白小鼠的毒性，并得出小鼠的尾静脉注射给药LD50=23.348～30.65mg/kg，腹腔注射给药LD50=35.948～44.128mg/ kg，各重要器官肉眼未见出血、坏死等异常表现，表明其毒性甚微。这为今后研制更纯、毒性更小和更有效的抗凝新型药物提供了依据,这也是本实验预期想达到的目的。有关该蛋白的药物代谢和长期毒性实验还需进一步研究。

    【参考文献】

    1  覃公平．中国毒蛇学，第2版.南宁：广西科学技术出版社，1998，511-512.

    2  黎渊弘,黎肇炎,林发全，等．短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白的分离纯化及鉴定.中国药理学通报，2006，22(7):831-835.

    * 基金项目：广西研究生教育创新计划资助项目（2006105981007 D10）

    作者单位： 1 530021 广西南宁，广西医科大学药学院药理教研室

    2 530021 广西南宁，广西医科大学蛇毒所

    3 530021 广西南宁,广西医科大学第一附属医院

 　(编辑：石  岚)