四川大学最新文章发表siRNA新方法

        来自四川大学华西医学中心微生物学教研室，成都生物制品研究所（Institute  of  Chengdu  Biological  Products）的研究人员通过构建质粒pAd-hTR证明了hTR  siRNA在HeLa细胞系中有效和特异的端粒酶的敲除，从而指出了这种siRNA表达重组腺病毒系统在癌症基因治疗方面的前景。这一研究成果公布在《Cancer  Gene  Therapy》杂志上。

        领导这一研究的是四川大学华西医学中心微生物学教研室主任李明远教授，其早年毕业于华西医科大学医学专业，之后在美国著名的St.  Jude  Children’s  Research  Hospital学习，学习了基因敲除、转基因和基因沉默等现代分子生物技术。目前担任四川大学华西医学中心微生物学教研室主任，中华医学会微生物学与免疫学会第六届委员会常委，《中国病原生物学杂志》、《四川大学学报（医学版）》、《国际检验医学杂志》和《西部医学》等杂志编委，《中国普外基础与临床杂志》审稿人，国家自然科学基金同行评审专家。

        RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象,  是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制,  同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色，它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。

        RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径:  siRNA(small  interference  RNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-stranded  RNA)引发的,  dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(RNA-  induced  silencing  complex,  Dicer)切割成21~26  nt长的siRNA,  通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-induced  silencing  complex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默。而miRNA途径中miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21~24个核苷酸),  由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpin  RNA,  hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物,  可以结合并切割特异的mRNA而引发RNA沉默。尽管引发沉默的来源不同,  但siRNA  和miRNA  都参与构成结构相似的RISC,在作用方式上二者有很大的相似性。

        由于RNAi可以作为一种简单有效的代替基因敲除的工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域得到了越来越多的重视。为此被Science评为2001年最重要成果之一。RNAi，即引入双链RNA，通过特异性结合互补链从而抑制基因表达/引发转录后沉默。许多的研究人员开始用RNAi作为一种工具研究基因功能。较早的哺乳动物RNAi实验中，siRNAs通过化学方法合成。进一步的，开始有了商业化的体外转录方法合成siRNA的试剂盒提供，比化学合成方法经济。现在已有研究小组开发表达载体，能够在哺乳动物细胞中持续表达siRNAs。

        在RNAi实验中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。

        通过质粒表达siRNAs大都是用Pol  III启动子启动编码shRNA(small  hairpin  RNA)的序列。选用Pol  III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol  III  启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。

        此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久（比如Clontech（现属于Takara）的RNAi-Ready表达载体）。另外带有荧光标记的siRNA表达载体也受到研究者的重视与欢迎，因为带荧光标记的表达载体，可以让研究人员通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率。可通过荧光显微镜观察含有shRNA的细胞或通过流式细胞仪富集被转染的细胞。同时荧光蛋白的表达与shRNA的表达是独立的，因此不影响shRNA基因沉默的效果。

        在这篇文章中，研究人员将编码人类端粒酶RNA（human  telomerase  RNA，hTR），长67bp的寡核苷酸引入pSIREN——一种重组腺病毒构建中的穿梭载体。然后将U6-RNA启动子和siRNA编码insert从pSIREN上剪切下来，亚克隆进pAdeno-X，构建出了质粒pAd-hTR。

        接着研究人员将pAd-hTR转染进哺乳动物细胞系HEK-293，获得了携带有hTR靶向的siRNA（Ad-hTR-siRNA）的腺病毒。通过一系列的实验，研究人员证明了Ad-hTR-siRNA介导的端粒酶沉默在HeLa细胞中的作用。同时将Ad-hTR-siRNA与Ad-NT-siRNA进行比对，发现前者能极大的降低HeLa细胞中hTRmRNA水平（by  70.21%），和端粒酶活性（by  58.87%）。而且会引起HeLa细胞凋亡。

        利用Ad-hTR-siRNA进行皮下肿瘤异种移植治疗可以减缓肿瘤的生长，其中至少部分是由于体内细胞凋亡（P<0.05）。总而言之，这些研究结果证明了hTR  siRNA在HeLa细胞系中有效和特异的端粒酶的敲除，从而指出了这种siRNA表达重组腺病毒系统在癌症基因治疗方面的前景。

                        （生物通：张迪）



附1：

        李明远  

        教授，博士研究生导师，  1954年7月出生，汉族，中共党员。  

        1982年11月毕业于华西医科大学医学专业77级，获医学学士学位；

        1989年10月毕业于华西医科大学微生物学与免疫学专业，获医学硕士学位；

        2001-2002年，在美国著名的St.  Jude  Children’s  Research  Hospital学习，学习了基因敲除、转基因和基因沉默等现代分子生物技术。  

        1982年12月至今，一直在原华西医科大学微生物学教研室工作，历任助教、讲师、副教授和教授。现任四川大学华西医学中心微生物学教研室主任，中华医学会微生物学与免疫学会第六届委员会常委，《中国病原生物学杂志》、《四川大学学报（医学版）》、《国际检验医学杂志》和《西部医学》等杂志编委，《中国普外基础与临床杂志》审稿人，国家自然科学基金同行评审专家。

        先后被评为四川省学术与技术带头人，四川省卫生厅学术带头人，四川省病原生物实验室生物安全及医用特殊物品出入境审批专家。自参加工作以来，一直坚持工作在教学和科研的第一线。在教学方面，做到既教书又育人，深受本科学生的欢迎。作为研究生导师，已培养毕业硕士研究生9名，博士研究生3名，目前有在读博士和硕士10余名。在教材建设方面，主编和参编了卫生部规划教材多本，现又被遴选为十一五规划教材主编。在科研方面，负责承担国家自然科学基金棉上项目3项，卫生部课题1项，教育部课题2项，四川省科技厅项目2项；并参加国家863课题1项。负责和主研的两个科学研究项目先后获四川省科技进步三等奖，已在国内外发表论文50余篇。