用羟基磷灰石纳米粒作内耳基因治疗新载体的体内外研究

2008年08月01日 《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志》-2008年1期 -51-57页 医学空间（MEDcyber.com）8月1日消息，该项研究目的是研制羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAT）纳米粒，评价其作为新的内耳基因转染载体的可能性。方法采用用化学共沉淀-水热合成法制备HAT载体。经DNA电泳做不同pH值和HAT含量的DNA结合实验，了解HAT纳米粒对DNA的结合和保护作用；用四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒对宫颈癌上皮Hela细胞的毒性；用Hela细胞和小鼠耳蜗原代螺旋神经节细胞做神经营养素3（neurotrophin 3，NB）体外转染实验（绿色荧光蛋白基因荧光显微镜法）及NB的蛋白印迹分析，观察HAT介导的NB基因对活细胞的体外转染能力和基因表达情况；经实验性兴奋性耳毒性损伤豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT纳米载体-含增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）质粒载体-NT3基因复合物（HAT—pEGFPC2-NT3），用免疫组化（二氨基联苯胺法）观察NT3在耳蜗的表达，以了解HAT纳米载体在活体动物耳蜗介导基因转染的能力。结果含量250．0μg／ml，pH值3～7是这种长约40～50nm的短棒状HAT纳米粒能完全结合重组质粒pEGFPC2-NT3的最低含量混悬液和最佳pH环境，并可有效保护基因不被核酸酶（DNase Ⅰ）破坏。四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒从62．5μg／ml至500．0μg／ml4种混悬液对Hela细胞存活率无明显影响，细胞形态无变化。EGFP荧光显微镜观察显示，HAT纳米载体对Hela细胞的基因转染率为15．7％±2．6％（-↑x±s）；将HAT—pEGFPC2-NT3转染培养的小鼠耳蜗神经元，也可见明显的EGFP表达。NT3免疫组化显示，向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT—pEGFPC2-NT3，可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达。得出结论HAT纳米粒不仅可介导NT3基因的体外转染，而且可介导其耳蜗活体转染；尽管转染率有待提高，但由于没有病毒载体转染造成的生物威胁，仍不失为一种很有研究价值的非病毒型内耳基因治疗载体。