胞外体最新研究进展

分泌的称作胞外体(exosome)的囊泡(vesicle)第一次发现是在将近30年前。但是，当初人们仅仅认为它是垃圾桶，它的工作是丢弃不想要的细胞组分，因此在第一次发现后接下来的10年，这些小囊泡一直很少有人研究。不过，过去几年，证据开始积累，表明这些细胞中的垃圾桶也作为信使，竟然传递信息到相隔较远的组织。胞外体含有细胞特异性的蛋白质、脂质和遗传物质，这些装载物运送到其他的细胞，从而改变它们的功能和生理。



不过最近几年人们对胞外体的研究兴趣越来越浓。快速扫视一下发表的论文就能证明这种趋势：2003年仅有大约20篇PubMed引用的含有“胞外体”单词的论文得以发表，2007年刚好超过60篇，从那以后将近有500篇关于胞外体的研究文章得以发表。接下来将谈谈胞外体的研究历史、难题、挑战和潜在的应用。



胞外体基础



胞外体是由大多数类型细胞分泌的膜小囊泡。内囊泡(internal  vesicle)通过称作多囊泡胞内体  (multivesicular  endosome,  MVE)的细胞区室通过向内出芽的方式形成。当MVE与细胞膜融合时，这些内囊泡就作为胞外体被释放到胞外，这些胞外体能够运行到距离较远的组织从而影响细胞行为和生理上很多方面。



如图2所示，胞外体形成的第一步是，MVE向内出芽形成小的内囊泡，这些内囊泡含有蛋白质、mRNA和miRNA①。当MVE与细胞膜融合时，这些内囊泡作为胞外体被释放到胞外②。或者，MVE能够与溶酶体融合，而溶酶体能够降解MVE中包含的物质③。一旦胞外体到达它们的目的地，而目的地通常是由胞外体表面上的特异性配体结合的方式决定的，这样胞外体能够以两种途径进入靶细胞：通过靶细胞胞吞作用摄入到细胞内④，或者通过融合到靶细胞膜，从而直接释放它包含的物质到细胞质中④。细胞也分泌其他膜来源的囊泡，比如核外颗粒体、脱落的囊泡或微泡，它们也是直接从细胞膜出芽产生的⑥。已知这些囊泡也携带活性的蛋白质和RNA以及一些以前从未在胞外体中描述过的化合物，但是它们对距离较远的组织的影响人们知之甚少。



胞外体：历史



胞外体尺寸小(直径大约150纳米或者更小)，能被大多数类型细胞分泌出来。它们形成于细胞内称作多囊泡胞内体(multivesicular  endosome,  MVE)的区室中，其中这种多囊泡内体是将少量细胞质及其包含的物质带到膜包围的小囊泡里。MVE最初被认为只是有助于运输胞外细分子到溶酶体中进行降解。但是，大约25年前，研究人员描述了一个相反的过程---发育中的红细胞MVE与细胞膜融合，释放出它们所包含的物质，包括众多小囊泡(后来被称作胞外体)，到细胞外面。



为了证明这一过程，研究人员把未成熟的称作网状细胞(reticulocyte)的红细胞，在放射性的转铁蛋白或者结合到转铁蛋白的细胞表面受体的放射性抗体存在下，进行培养。每隔15分钟，他们固定一部分细胞，用电子显微镜对它们拍摄照片，这样当转铁蛋白或它的细胞表面受体通过细胞内吞途径从细胞表面进入细胞，再经过不同的细胞区室进入MVE时，就可以追踪其行迹。仍然结合到受体上的转铁蛋白被扣押在小囊泡中，而这些小囊泡则是在更大的MVE内部形成。令人吃惊的是，显微图片表明一些MVE与细胞膜融合，将这些携带转铁蛋白及其受体的小囊泡释放到细胞外部。



然而接下来的15年，胞外体被人们遗忘了---直到1996年，Raposo发现免疫细胞如B淋巴细胞也分泌胞外体，和这些囊泡携带膜包围的对适应性免疫反应而言必不可少的分子[1]。在此两年后，进一步的研究还证实另一种分泌胞外体的细胞类型：树突细胞(dendritic  cell)，它的胞外体携带功能性的免疫试剂，而这些试剂能够促进小鼠产生抗肿瘤免疫反应[2]。这些结果为提出下面假说提供基础：胞外体可能在细胞间通信中发挥着积极作用，同时也促使人们探索它们的临床应用。法国古斯塔夫洛塞研究所(Gustave  Roussy  Institute)在当前领导的第二期临床试验中，正在测试将胞外体作为一种新形式的辅助疗法，来治疗不能手术的肺癌[3]。



在过去几年，大规模蛋白分析技术的发展允许研究人员详述胞外体运输的货物类型[4]。不同类型细胞分泌的胞外体携带特异性的一组蛋白，而且这些蛋白不同于凋亡细胞释放的膜囊泡中含有的蛋白，从而表明胞外体是由活细胞积极地分泌的。尽管一些类型细胞在没有任何明显的刺激下就释放这些囊泡，但是分泌胞外体的信号仍不清晰。其他类型的细胞，如B和T淋巴细胞，仅当通过结合细胞表面受体而给与刺激的情况下，才会分泌数目可测量的胞外体。



最近对体外纯化的胞外体的研究表明囊泡能被其他细胞捕获，因而传递胞外体内部或表面包含的一些信息。比如，抗原呈递细胞通过胞外体分享捕获的和消化的病原物，增加针对侵入者的免疫反应的范围和强度。其他胞外体结合的分子能够诱导它们遇到的靶细胞失活或者甚至是死亡。比如，一些胞外体在它们的表面展示Fas配体，一旦该配体结合到Fas受体(也被称作死亡受体)就启动细胞凋亡。



2007年，瑞典人Jan  L?tvall领导的一个研究小组发现了胞外体内部含有mRNA和microRNA[5]。而且，体外实验表明这些mRNA能在靶细胞中翻译表达为蛋白质，从而第一次提供证据证明胞外体转移遗传物质。这一非凡的发现不仅指示一种新形式的细胞间通信，而且还表明就意义上而言，胞外体可能行为表现类似于病毒，因为它们携带遗传信息，而且这些遗传信息能在它们“感染”的细胞中翻译为蛋白。该发现以及伴随的对microRNA的研究已促进人们最近对胞外体研究的热情，和相关发表文章的激增。



功能迷雾



相对于单分子调节物，如脂质、激素或细胞因子而言，考虑到胞外体复杂的结构，它们能够给它们遇到的细胞带来更加强有力的影响。举例来说，胞外体在它们的表面携带特异性模式的配体和受体，从而可能允许它们瞄准携带合适的反配体(counterligand)的特异性类型细胞。再者，它们携带的大量蛋白质、脂质，甚至核酸组分，能够影响靶细胞内部的多种信号传导途径，而单个分子通过结合靶细胞表面上单个受体的方式仅仅启动单个途径。



根据分泌胞外体细胞的类型和生理状态，胞外体与它的受体细胞相互作用诱导的变化能够差异很大，要么能够有助于防御疾病，要么在一些情况下恶化疾病[3]。比如，成熟的树突细胞分泌的胞外体携带抗原，或者嵌入在它们的脂双层中的MHC-肽链复合体，能够诱导抗原特异性的免疫反应。另一方面，在免疫抑制试剂存在的培养物中，小鼠树突细胞分泌的胞外体能够促进免疫耐受性。类似地，非病原性的分枝杆菌感染的巨噬细胞释放的胞外体携带细菌抗原，然后被其他的抗原呈递细胞摄取从而促进免疫反应。相反地，病原性的分枝杆菌菌株感染的巨噬细胞释放的胞外体抑制巨噬细胞激活和细胞因子释放，因而抑制将由分枝杆菌抗原诱导的免疫反应。这种致病菌在胞外体通信层次上似乎已进化以便有利地控制宿主的免疫系统，尽管其中的细节仍然有待阐明。



癌细胞分泌的胞外体携带来自肿瘤的抗原，能够被树突细胞捕获并被用来呈递肿瘤抗原，从而激活针对这种癌症的免疫细胞。然而，这些胞外体也含有各种各样的免疫抑制分子，而且这些分子要么能够使得T淋巴细胞或自然杀伤细胞(natural  killer  cell)失活，要么促进抑制免疫反应的调节性T淋巴细胞或骨髓细胞(myeloid  cell)的分化。人们仍不清楚这些相互对立的影响的净效应对患有癌症的个人而言是有益性的还是有害的。几个研究小组的研究结果已经表明肿瘤分泌的胞外体通过抑制抗肿瘤免疫反应，或者通过在肿瘤转移过程中促进血管生成或肿瘤迁移到身体其他部分的方式，从而促进肿瘤的生长[6]。然而，即便是发现来自肿瘤的胞外体在癌症病人体中进行循环，这可能仅仅是肿瘤扩张的结果，可能并不意味着这种膜囊泡积极地参与肿瘤演化(tumor  progression)。在癌症病人身上，肿瘤分泌的胞外体促进肿瘤生长的证据仍然缺乏。



其他组织或细胞也分泌携带免疫抑制分子的胞外体。比如，胎盘来源的囊泡携带针对自然杀伤淋巴细胞和其他免疫系统组分的抑制性配体，从而可能阻止对胎儿的免疫攻击。类似地，支气管肺泡液体中存在的胞外体和其他囊泡能够将一种过敏原的抗性转移给其他动物。当从已经耐受某种过敏原的小鼠中纯化的胞外体注射进天然小鼠，这种对该过敏原敏感的小鼠也对该过敏原引发的过敏性反应产生抗性。另一方面，支气管肺泡液体中的胞外体也能够增强促炎症反应，因为当从哮喘病人中纯化的胞外体同支气管上皮细胞一起培养时，支气管上皮细胞作出反应，分泌出促炎症的细胞因子。人们最近已发现，真核生物的寄生物或致病菌分泌胞外体[7]，其中这些胞外体能够有助于宿主产生对入侵者的耐受性(通过抑制免疫反应)，或者，相反地，促进宿主在入侵者存在时产生病理性炎症反应。



除了免疫系统之外，胞外体可能影响其他的生理功能。神经细胞、上皮细胞、肌细胞和干细胞分泌的胞外体可能存在的功能包括促进组织修复、神经系统内通信以及诸如朊病毒蛋白和淀粉样沉积之类的病理性蛋白质的形成和转移。比如，神经元分泌携带神经传递质(neurotransmitter)受体的胞外体，因而能够参与胞外空间的神经传递质的清除从而阻止信号传导，而且/或者传递这些受体到其他细胞，从而使得它们对神经传递质作出反应。总之，不容置疑的是，在未来几年，其他的系统和功能肯定会出现。



胞外体研究的挑战



尽管有关胞外体诱导靶细胞发生变化的数据不断增加，但是所有这些研究都是在体外浓缩的囊泡中进行的。在大多数情况下，细胞培养物放置在使细胞死亡最小化的条件下以便确保待分析的囊泡不受破裂的、临死的细胞溅出的随机性细胞碎片的污染。然而，考虑到这种技术上的挑战，对来自整个器官的胞外体进行的可靠性纯化仍然是难以实现的。机械或化学上的组织破坏将不可避免地弄碎一些细胞，使得将自然存在于胞外空间的胞外体很难与人为造成的破裂细胞中释放的囊泡分离开。



再者，对研究人员而言，将胞外体与其他的分泌出的囊泡，如核外颗粒体(ectosome)、脱落的囊泡(shed  vesicle)和微泡(microvesicle)---直接从细胞膜上出芽而出---区分开来也是一个长期存在的挑战。类似于胞外体，膜微泡含有各种各样的活性分子，如细胞因子，生长因子受体和RNA，但是它们也含有在胞外体中没有被描述过的化合物，如金属蛋白酶---该酶降解胞外基质组分而且参与肿瘤转移。胞外体能够通过在不同转速的超离心方法与不同大小的囊泡分离开来，这是因为较大的囊泡要比较小的囊泡在较低的转速下沉淀，但是不同细胞内来源(比如胞外体和某些细胞膜来源的囊泡)的大小类似的囊泡不能通过这种方法分离，这样就很难确定胞外体特有的影响。



用来纯化的胞外体进行的大多数胞外体研究这一事实也使得人们很难了解使用的大量膜囊泡在体外和模式动物中观察描述的影响是否具有生理学上的相关性。确实，一些胞外体研究人员怀疑囊泡在体内是否确实有生理学上的功能。



解答这个问题则需要一些方法来抑制或增强胞外体分泌，但同时又不影响其他膜囊泡的分泌，或者蛋白质或脂质调节物的一般性分泌。几个研究小组当前正在开发这样的方法，特别是通过解析参与胞外体形成及其与细胞膜融合的分子机制。然而，一点也不奇怪的就是，人们在这些机制上还未达成共识。确实，基于不同的细胞类型，在胞外体的生物形成和分泌过程中，人们已描述过许多不同的分子。研究人员已经提出其他的方法来阐明胞外体在体内的生理功能，比如产生带有功能性蛋白的修饰性表达的胞外体，或者将酶插入到胞外体中从而通过测量酶活性的方法来确认靶细胞。在遗传修饰过的小鼠中采用这些方法将会是战胜这些挑战的下一步。



研究分泌的膜囊泡及其它们作为细胞间信使的角色是一个非常有趣的领域，伴随着新的观点，假设，以及由此产生的疑问远比给出的答案来的快得多。2011年在巴黎居里研究所召开的国际胞外体研讨会(International  Workshop  on  Exosomes)让大多数长期的胞外体和囊泡狂热爱好者遇见很多新来者，并与他们交换思想，以及指出当前在技术、定义和特征上的问题。这次讨论会议最终还达成以下共识，即继续保持本次非常有益的研讨会的这种势头，设置未来年会和虚拟空间来鼓舞进一步讨论，并成立一个科学协会致力于胞外体和分泌的膜囊泡的研究。基于这种目的，下次研讨会安排于2012年4月在瑞典哥特堡市召开；一个脸谱(Facebook)网页(称作胞外体、微泡和其他分泌的膜囊泡)和一个用于比较胞外体中蛋白质和RNA组分的网站如今成立并在运行，其余的安排也有望很快确定下来。



膜包围的生物标记？



确定胞外体中的RNA以及用于核酸分析的高通量技术的开发已经激起最近在这些膜囊泡中存在的遗传物质序列方面的研究论文的急增。并不是一个细胞中存在的所有mRNA最终都出现在胞外体中，这就表明只有特异性得到mRNA序列包装在这种释放出来的囊泡内部[5]。然而，是否存在一组mRNA一贯地靶向到特定类型细胞的胞外体，就像胞外体蛋白质那样，仍然有待人们来确定。尽管也不清楚是否存在microRNA(miRNA)特异性地靶向到这些分泌的囊泡中，但是人们已经在很多种类的胞外体制备中观察到miRNA分子。



尽管关于携带mRNA和miRNA的囊泡的性质充满着不确定性，但是一些生物技术和制药公司已经开始启动一些开发项目，利用分泌的囊泡中包含物作为生物标记来诊断各种种类的疾病。包裹在膜囊泡内部的RNA分子受到保护而不会被RNA酶降解，因而允许把它们从诸如血浆、尿液、牛奶、精液或唾液之类的液体中进行有效回收。不同实验室中正在进行的研究工作旨在将从正常细胞系和癌细胞系分离出的囊泡中的RNA和蛋白质序列与在患有癌症和其他疾病的病人的生物液体里发现的胞外体中的那些序列进行比较。提出把胞外体及其包含物作为新的生物标记仍嫌太早，但是考虑到当前进行的努力，接下来几年人们肯定会确定这些标记是否存在以及是否有用。然而，值得关注的是，循环miRNA  (circulating  miRNA)也能够被蛋白复合体保护而免于受到RNA酶降解，因而相对于膜包围的miRNA，蛋白保护的miRNA作为标记的相对重要性也将不得不接受评估[8]。