单细胞转录组分析技术的发展与应用

        基因表达是将基因携带的遗传信息转变为可辨别表型的整个过程，以DNA为模板合成RNA转录的过程是基因表达过程的第一步，也是基因表达调控的关键环节。转录组分析技术是通过在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律，将单细胞的基因型与表型联系起来的一种强有力的方法。近日发表在《自然方法学》（Nature  methods）的一篇最新论文中，作者详细地综述了单细胞转录组分析技术的历史、进展、潜在应用和未来的发展。  



        所谓转录组，广义上讲就是指单个细胞中转录出来的所有RNA成分，而狭义上讲则是指RNA聚合酶II活性的多聚腺苷酸产物。近年来高通量测序技术取得了日新月异的发展，科研人员通过RNA测序(RNA-seq)技术即可获得高分辨率的单细胞转录组信息。利用这些信息科研人员能更深入地了解单细胞在决定细胞命运的关键阶段对信号及其他环境因素产生反应的机制以及获得异常表型的时间。生物体中几乎所有细胞都有着相同的基因型，然而在不同的细胞类型中反应基因表达状况的转录组却受到细胞表观遗传学状态的影响显示出其独特性。因而科学家们常以此来解析多细胞生物体发育过程中生理功能、行为及表型下的基因调控网络。



        由于不同的细胞具有独特的转录组，从理论上讲转录组分析应该在单细胞水平上开展。此外，这一分析还应涵盖单碱基分辨率下所有类型全长RNAs的准确序列、数量、定位、活性（例如活性转录或降解）以及修饰等信息。然而事实上，mRNA,  rRNA,  tRNA和小核RNA可能在成千上万的不同位点有超过100个结构各异的转录后修饰。且由于受到检测的敏感度等技术限制，大部分转录组的研究还只能在几十万或上百万个细胞水平上才能开展。在某些情况下由于无法收集大量的细胞，例如早期胚胎，使得转录组分析极其困难。



        近期的研究表明即使在极其相似的细胞类型中基因表达也常常显示异质性。这种转录组的随机变异对于细胞的命运起着重要的决定作用。例如近期哈佛大学的Sunney  Xie和同事们证实随机的单分子事件可启动单个细菌细胞的表型转换。转录组的差异还可提供疾病组织中细胞类型组成的关键信息，例如包含少量癌症干细胞的肿瘤。在相似细胞类型中基因表达的异质性有可能是受到了基因组表观遗传学状态、生物钟、细胞周期、细胞微环境以及内在转录“噪音”等差异的影响。事实上，从细菌到人类的所有模型生物体中基因表达均具有随机性。这一部分是由于单个细胞的大多数基因中，基因组DNA模板仅有一个（原核生物）或两个（大多数真核生物）拷贝用于转录，且启动表达的分子事件本身具有随机的特性。为了了解基因表达异质性和随机性的基础及重要性，非常有必要在单个细胞中对转录组进行检测。



        单细胞转录组分析的历史



        早在20多年前Norman  Iscove就率先利用PCR指数扩增单细胞cDNAs的方法在单细胞水平上开展了转录组分析。随后，James  Eberwine又利用T7  RNA聚合酶体外转录（IVT）对cDNAs进行了线性扩增。这些技术帮助科学家们更深入地了解了哺乳动物神经细胞发育及功能分子机制。  

              

        而后，高密度DNA芯片的商业化应用进一步推动了单细胞微阵列技术的发展。然而尽管这一技术具有高效性，可用于获得全基因组基因表达模式，但扩增的cDNA片段一般较短（几百个碱基对），且不能用于检测选择剪接生成的转录物。目前这一技术仅适用于检测已知基因。



        单细胞转录组分析的应用



        单细胞转录组分析可用于确定全基因组范围基因调控网络，可与目的基因过表达、敲除或沉默技术合并用于揭示靶细胞中基因表达调控机制。尤其是用于分析早期胚胎发育过程中干细胞与细胞的分析因为这些细胞亚群具有高动态和异质性特征。此外，由于基因表达的随机性特性可显著地影响单个细胞的命运及表型。解析细胞群中基因表达的异质性亦是单细胞分析的重要研究方向。例如在胚胎干细胞中基于Nanog,  Rex1  或  Stella的表达情况即可了解细胞亚群的异质性。



        单细胞转录组分析的另一个应用方向则是确定不同亚细胞室区的基因表达谱。众所周知在神经元中mRNAs需从细胞体活性转运至轴突或树突进行翻译。单细胞转录组分析可用于检测在轴突或树突特异性定位的mRNAs，从而用于确定这些神经元的生理功能。



        由于新一代测序技术可提供单碱基分辨率的信息，单细胞转录组分析还可用于分析单个细胞中等位基因特异性的基因表达，以鉴别两等位基因间的单核苷酸多态性。这将有助于我们深入了解单个细胞中遗传元件与表观遗传学元件影响等位基因特异性表达的机制。



（生物通：何嫱）