动物细胞大规模培养技术有待突破

2006年04月18日 中国医药报 12 今年1月出版的由国家发展和改革委员会高技术产业司与中国生物工程学会共同编制的《中国生物技术产业发展报告（2005）》一书指出：细胞大规模培养技术作为生物制药中最为关键的技术，已成为我国生物技术药物产业化最难跨越的"门槛"。

近日，记者就动物细胞大规模培养的相关问题采访了军事医学科学院生物工程研究所副研究员胡显文博士等专家。胡博士是我国生物制品--重组人尿激酶原[中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达]的主要研制者之一，这一用于血栓治疗的新药现已完成III期临床试验。动物细胞大规模培养的重要性原核细胞表达产品的工艺并不复杂，既易操作控制，又能节约生产成本；大肠杆菌作为表达受体早已成为生物制药产业中最受青睐的工程菌，人们对其理论研究和实践应用都已十分成熟，那么为何还要构建以哺乳动物为代表的真核细胞表达系统呢？

据胡博士介绍，生物制药的发展初期都是表达一些分子量较小、结构简单的蛋白质，如胰岛素、生长激素、干扰素和集落刺激因子等，这些蛋白质药物的氨基酸残基个数大都在200以下，一般只有1-2对二硫键或者没有二硫键，并且没有糖基化位点或者糖基化对蛋白质生物活性的影响很小，因此采用大肠杆菌（原核细胞）表达系统既简便又经济。但是，生物制药的发展趋势是从以细胞因子等激动剂为主的产品，转变为以拮抗作用为主的新生物技术药物，如天然IL-1拮抗剂，中和肿瘤坏死因子的Remicade单克隆抗体，a-1-蛋白水解酶抑制剂等。越来越多的分子量大、结构复杂的功能性蛋白得到开发，如抗体和酶，都是分子量在50kD~200kD的糖蛋白。由于这些蛋白结构复杂，二硫键多，并且翻译后的修饰如糖基化对蛋白活性的影响很大，采用原核表达系统往往不能满足蛋白表达的需要。而采用哺乳动物细胞表达既能保证重组蛋白质二硫键的正确配对和蛋白质折叠，又能保证蛋白质的糖基化，从而使由哺乳动物细胞表达的重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上保持很高的一致性。

此外，许多用于防治人类疾病的糖蛋白，其分子量大、二硫键多并且空间结构复杂，结构简单的原核细胞根本无法表达，只有使用CHO或其他哺乳动物细胞表达系统，这些蛋白的生产才有可能。

由此看来，突破和推广动物细胞大规模培养技术意义重大！然而，我国生物制药产业中的动物细胞大培养技术却面临着产业化的困境。已成为生物技术创新的技术门槛胡博士说，为了获得大量治疗性蛋白而进行的动物细胞大规模培养大致分为三个步骤：外源基因（目的基因）的获取，真核细胞表达外源基因系统（细胞株）的建立以及重组动物细胞的大规模培养即产业化。

其中涉及的层面很多：治疗性蛋白序列的测定，目的基因的提纯、序列测定、人工合成，宿主细胞的选择，外源基因与载体共同导入宿主细胞并与其染色体的整合，重组细胞的大规模培养等。这其中的任何一步都不能有差错，否则将直接影响下一步的操作，但确保重组细胞的多代增殖和目的基因的高效表达则最为关键。中国科学院生物物理研究所的相关专家表示，确保重组细胞的多代增殖除了要保证细胞分裂增殖的环境营养充足、洁净无菌等外因之外，还得面对细胞自身的衰老凋亡问题。

近年来，细胞衰老凋亡的形态学特征和分子机制已得到初步认识，学术界认为细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。目前，可以通过阻断胞外信号来缓解细胞凋亡，但是对线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase的作用机制还很难做出解释。至于目的基因的高效表达，则与目的基因在宿主染色体上的位置以及宿主染色体的自我复制和表达调控有关，其中的机制有待深入研究。发酵液内细胞的生产效率与细胞密度和细胞的生命活力有关，这不仅需在重组细胞的构建之初选择高效稳定的表达系统，还得创造和维持近乎苛刻的细胞培养环境。采用精确有效的工艺手段，杜绝外源因子（如粉尘、杂菌等）对培养环境的污染并非难事，对培养液的温度、pH值、溶氧系数、二氧化碳浓度以及生长因子的浓度等这些客观因素的综合控制也有技术上的支持，但是无论是在实验室用转瓶培养还是在工业上通过大型发酵罐发酵，目前都难以达到"高密度、连续高效培养和高表达"的理想状态。重组动物细胞表达产品有待突破虽然原核细胞表达系统的构建已经十分成熟，但从我国生物制药产业的现状和发展趋势来看，高效的真核细胞表达系统还有待突破。

有资料显示：由于动物细胞培养技术的复杂性，目前我国批准上市的哺乳动物细胞尤其是CHO细胞表达的产品很少，只有促红细胞生成素（EPO）、CHO基因工程乙肝疫苗、以及最近批准上市的治疗性抗体药物益赛普（有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Enbrel）和泰欣生（有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Erbitux）等少数几种生物技术药物，而美国食品药品管理局在2000年1月~2004年12月批准上市的31种生物技术药物中，约70%为哺乳动物细胞表达的重组蛋白，我国生物制药与欧美国家的主要差距在数量上的体现就是哺乳动物细胞表达的产品寥寥无几。

此外，我国学术界现存的一些避重就轻的浮躁心态也制约着我国动物细胞大规模培养的发展。例如，在治疗性抗体的研发方面，主张研制开发抗体片段或鼠源抗体一直是我国学术界的主流意见，这一主张的深层原因是：我国用基因工程技术构建由哺乳动物细胞表达的完整抗体分子的生物工程上游技术比较落后，而表达抗体片段采用的大肠杆菌表达系统和生产鼠源抗体采用的鼠-鼠杂交瘤技术，在构建和操作上相对简单易于掌握，因此学术界普遍提倡以抗体片段或鼠源抗体作为治疗性抗体，还称这更符合我国国情，这种故步自封的做法导致了我国在生物制药最重要的研究开发领域的极大落后。